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第一部分右美托咪定对大鼠急性脊髓损伤的神经保护作用研究目的本研究采用改良Allen法建立脊髓损伤模型,并采用不同途径给予右美托咪定,分析右美托咪定不同给药途径对大鼠急性脊髓损伤的神经保护作用,旨在为阐明右美托咪定脊髓损伤保护的作用机制以及更好地应用于临床奠定理论基础。方法(1)采用改良Allen法建立级随机性打击损伤Wistar大鼠模型。将Wistar大鼠分为5组,每组36只,分别为假手术组;对照组;鞘内注射组;静脉注射组;鞘内注射组+静脉注射组。运用BBB量表对5组大鼠在1、24、48h时后肢运动功能进行评价。(2)采集各组大鼠48h时的受损脊髓段样本并制作石蜡切片,经HE染色后观察病理组织学变化情况。(3)TUNEL染色实验检测各组大鼠受损组织细胞凋亡情况。(4)采用荧光定量PCR和westernblot检测炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-αm RNA。(5)分离培养大鼠大脑星形胶质细胞和脊髓神经元,并对两种细胞进行鉴定,鉴定脊髓神经元与星形胶质细胞共培养体系。(6)将细胞分为对照组、低浓度右美托咪定组(1nmol/m L)、中浓度右美托咪定组(10nmol/m L)、高浓度右美托咪定组(100nmol/m L),用CCK8实验检测48h后各组细胞的增殖活性。结果(1)神经运动功能分析结果表明,在急性脊髓损伤治疗后24h时,鞘内注射组、静脉注射组、鞘内+静脉注射组大鼠的BBB评分明显高于对照组(P<0.01);鞘内注射组大鼠的BBB评分与静脉注射组相比差异无统计学意义(P>0.05);鞘内+静脉注射组大鼠的BBB评分明显高于鞘内注射组及静脉注射组(P<0.01)。在治疗后48h时,鞘内注射组大鼠的BBB评分与静脉注射组相比差异仍无统计学意义(P>0.05);鞘内+静脉注射组大鼠的BBB评分明显高于鞘内注射组及静脉注射组(P<0.01)。(2)假手术组脊髓结构正常,神经元的轮廓清晰,核仁结构清晰且完整,胞质均为深染。对照组脊髓组织中可观察到多灶性出血,同时还可见大量神经元水肿、坏死,灰质中空泡形成,大量炎性细胞浸润,尼氏体发生溶解甚至消失,细胞核固缩变小。鞘内注射组、静脉注射组以及鞘内+静脉注射组神经组织结构损伤较对照组轻微,细胞发生轻度肿胀、细胞质均匀,其中鞘内注射组与静脉注射组观察结果相似,而鞘内+静脉注射组脊髓损伤程度较上述两组轻微。(3)在急性脊髓损伤治疗后1h时,各组脊髓损伤段凋亡细胞数量无明显差异(P>0.05);在急性脊髓损伤治疗后24h时,对照组、鞘内注射组、静脉注射组、鞘内+静脉注射组大鼠脊髓损伤段凋亡细胞数量均明显高于假手术组,差异具有统计学意义(P<0.01);与对照组相比,鞘内注射组、静脉注射组、鞘内+静脉注射组大鼠脊髓损伤段凋亡细胞数量均明显降低(P<0.01),其中鞘内注射组与静脉注射组相比无显著差异(P>0.05),而鞘内+静脉注射组大鼠脊髓损伤段凋亡细胞数量明显低于鞘内注射组,差异具有统计学意义(P<0.01)。在急性脊髓损伤治疗后48h时,鞘内注射组与静脉注射组相比无显著差异(P>0.05),而鞘内+静脉注射组大鼠脊髓损伤段凋亡细胞数量明显低于鞘内注射组,差异具有统计学意义(P<0.01)。(4)在急性脊髓损伤治疗后1h时,各组脊髓损伤段组织中IL-1β、IL-6、TNF-αm RNA水平无明显差异(P>0.05);在急性脊髓损伤治疗后24h时,对照组、鞘内注射组、静脉注射组、鞘内+静脉注射组大鼠脊髓损伤段组织中IL-1β、IL-6、TNF-αm RNA水平均明显高于假手术组(P<0.01);与对照组相比,鞘内注射组、静脉注射组、鞘内+静脉注射组大鼠脊髓损伤段组织中IL-1β、IL-6、TNF-αm RNA水平均明显降低(P<0.01),其中鞘内注射组与静脉注射组相比无显著差异(P>0.05),而鞘内+静脉注射组大鼠脊髓损伤段组织中IL-1β、IL-6、TNF-αm RNA水平明显低于鞘内注射组(P<0.01)。在急性脊髓损伤治疗后48h时,鞘内注射组与静脉注射组相比无显著差异(P>0.05),而鞘内+静脉注射组大鼠脊髓损伤段组织中IL-1β、IL-6、TNF-αm RNA水平明显低于鞘内注射组(P<0.01)。(5)细胞接种后4h时可见部分细胞贴壁生长,胞外观呈圆形,透光性强,细胞表面未观察到明显的突起伸出。在培养24h后能够观察到星形胶质细胞贴壁,位于培养瓶的底层,细胞外观为三角形、菱形或者多边形。视野下能够观察到部分细胞伸出多个粗短的突起,其浅层表面可见有神经元和少突胶质细胞等细胞,培养液内悬浮着未贴壁的坏死细胞和组织碎块。在培养至第7天时能够观察到星形胶质细胞明显增殖,胞核不明显,胞体扁平,可见大部分细胞表面伸出多个粗短突起,相互之间可接触,细胞贴壁紧密。在培养至第7~9天时细胞汇合度生长至70%~80%。在细胞接种4h后能够观察到部分细胞贴壁生长,细胞的外观呈圆形且透光性强,其表面无明显的突起伸出。在培养24h后能够观察到大部分神经元细胞贴壁生长,此时底层贴壁的细胞内还可见部分星形胶质细胞或成纤维细胞。GFAP免疫荧光染色结果显示,星形胶质细胞胞质被染成红色,胞核染成蓝色。视野下可见部分细胞表面伸出粗短的突起并与邻近的细胞相互接触。βIII-Tubulin免疫荧光染色结果显示神经元胞质被染成红色,胞核染成蓝色。胞表面可见多个突起且相互接触。(6)与对照组相比,低、中、高右美托咪定组细胞的增殖活性明显增高(p<0.01),且随着右美托咪定作用浓度的增高,神经元细胞的增殖活性逐渐升高。上述研究结果表明,右美托咪定对神经元的增殖具有促进作用。结论本研究发现采用鞘内+静脉注射途径给予脊髓损伤大鼠右美托咪定较单一途径(鞘内注射、静脉注射)给药在促进损伤后运动功能恢复、减少神经细胞凋亡以及缓解炎症反应方面效果更好,且对脊髓神经元无毒性作用。第二部分右美托咪定对大鼠急性脊髓损伤的神经保护机制研究目的研究右美托咪定对急性脊髓损伤后信号通路IKK/NF-κB的影响,探讨右美托咪定对脊髓损伤治疗的作用机制,为其应用于临床治疗提供理论依据。方法(1)将Wistar大鼠分为假手术组、对照组(脊髓打击后给予等量生理盐水)、BMS-345541组(鞘内注射IKKβ抑制剂BMS-345541(50μL/kg))、右美托咪定组(鞘内和静脉内各注射右美托咪定(3μg/kg))。采集各组大鼠受损脊髓段样本。(2)采用荧光定量PCR分别检测IKKβ和NF-κB m RNA的表达。(3)采用western blot法分别检测IKKβ和NF-κB蛋白的表达。结果(1)与假手术组相比,对照组、BMS-345541组和右美托咪定组大鼠脊髓组织中IKKβ和NF-κB m RNA的表达水平均明显增高(P<0.01);其中BMS-345541组和右美托咪定组IKKβ和NF-κBm RNA的含量明显低于对照组(P<0.01);与BMS-345541组相比,右美托咪定组IKKβ和NF-κB m RNA的表达水平明显降低。(2)与假手术组相比,对照组、BMS-345541组和右美托咪定组大鼠脊髓组织中IKKβ和NF-κB蛋白的表达水平均明显降低(P<0.01);其中BMS-345541组和右美托咪定组IKKβ和NF-κB蛋白的含量明显低于对照组(P<0.01);与BMS-345541组相比,右美托咪定组IKKβ和NF-κB蛋白的表达水平明显降低(P<0.01)。结论脊髓损伤能够促使IKKβ和NF-κB的含量明显增高,而右美托咪定则能够明显抑制IKKβ和NF-κB的表达,表明其可能通过抑制IKKβ/NF-κB信号通路缓解脊髓损伤后的炎症反应。