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鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis, DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus, DHV)引起的鸭类传染病,DHV分为DHV-Ⅰ型、DHV-Ⅱ型、DHV-Ⅲ型和新型DHV。DHV-Ⅰ型病毒入侵机体后能迅速复制,并能突破血脑屏障引起雏鸭急性死亡。研究表明,干扰素(Interferon, IFN)和白介素(Interleukin, IL)(?)抑制病毒在机体内的复制,而Toll样受体7(Toll-like receptor7, TLR7)通过识别病毒ssRNA激活依赖MyD88信号通路,活化免疫细胞而释放Ⅰ型IFN、IL-6、IL-12等细胞因子,起到抵御病毒的入侵及复制作用。已有试验表明,通过上调TLR7的表达可以抑制ssRNA病毒如丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)、呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus, RSV)及西尼罗河病毒(West nile virus, WNV)[3]在机体内的复制,但目前尚未见有关于DHV-Ⅰ型病毒感染对TLRs信号通路影响的研究报道。本研究通过分析鸭TLR7、MyD88、NF-κB、IL-6和IFN-α基因在雏鸭体内组织的分布情况,检测在DVH-Ⅰ感染鸭巨噬细胞0h、2h、8h、24h(?)(?)32h时,TLR7、MyD88、NF-κB、IL-6和IFN-α mRNA表达量,并用RNAi技术沉默鸭TLR7基因表达,拟探讨DHV-Ⅰ对TLRs信号通路的影响,了解机体对DHV-Ⅰ的识别及所引起炎症反应的机制,为进一步通过调节TLRs信号通路来防治DHV-Ⅰ感染提供理论和试验依据。1.鸭TLR7、MyD88、NF-κB、IL-6和IFN-α基因组织表达及序列分析参照NCBI公布序列设计鸭TLR7、MyD88、NF-κB、IL-6和IFN-α的特异性引物,建立RT-PCR检测TLR7、MyD88等5种免疫信号通路关键分子的nRNA在鸭心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑和法氏囊7个组织中的表达。基因组织表达图谱显示,在鸭7个组织中均检测到TLR7、NF-κB、IL-6和IFN-α mRNA转录产物；而MyD88在肾和脑组织中未见转录产物,但在其他组织中有表达。本试验检测到鸭TLR7、MyD88、NF-κB、IL-6和IFN-α基因主要分布于外周免疫器官,这可能是因这些基因参与机体免疫调节和炎症过程。迄今,尚未见有鸭MyD88与NF-κB基因序列的报道,对本试验克隆到的鸭MyD88和NF-κB部分基因进行测序并用BLAST比较相似性。结果显示,鸭MyD88、NF-κB基因序列与鸡、珍珠鸟等禽鸟类的相似性在90%左右,与人、鼠的相似性在80%左右；对核酸序列推导氨基酸序列进行的同源性比较发现,鸭MyD88、NF-κB与鸡、珍珠鸟等禽鸟类同源性最高,均为97%-100%；而鸭MyD88与人、鼠的同源性均为84%,鸭NF-κB与人、鼠的同源性分别为36%、34%。这表明,不同物种间的MyD88部分基因具有保守性,而NF-κB部分基因的保守性不高。2. DVH-Ⅰ对鸭TLR7、MyD88、NF-κB、IL-6和IFN-α mRNA表达量影响通过CFX Manager1.6软件对本试验建立的鸭TLR7、MyD88、NF-κB、IL-6和IFN-α引物建立其SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法进行分析,得出本法中TLR7、MyD88、 NF-ΚB、IL-6和IFN-α基因产物分别在80℃、85℃、83.5℃、91.5℃、82℃出现单特异性峰,基因扩增分别为102.2%、101.9%、99.4%、105.1%、94.4%,相关系数分别为0.999、0.993、0.999、0.997、0.989,均符合建立荧光定量PCR方法的标准,说明本试验所建立的检测鸭TLR7、MyD88等基因的荧光定量RT-PCR的特异性高。用所建立的荧光定量RT-PCR方法检测DHV-Ⅰ感染鸭原代巨噬细胞2h、8h、24h和32h时的TLR7、MyD88、NF-κB、IL-6和IFN-α mRNA相对表达量,并用duncan法分析组间的差异。结果显示,鸭TLR7和NF-κB mRNA表达量在DHV-Ⅰ感染细胞8h至24h间迅速升高；MyD88、IL-6和IFN-κ mRNA表达量在感染2h至8h间无明显变化,在感染24h时明显升高,表明DHV-Ⅰ能诱导鸭巨噬细胞上调TLR7的表达并增加IFN-α、IL-6的表达。TLR7、MyD88、NF-κB和IL-6mRNA表达量在感染32h时均显著下调,推测是由于TLR7表达量的成倍增加启动细胞TLRs信号通路负调控机制,降低整体信号通路分子基因表达。3RNAi沉默TLR7对鸭巨噬细胞表达细胞因子的影响本试验设计对与靶基因无同源性的荧光标记阴性对照siRNA,在Lipofectamine2000介导下转染鸭原代巨噬细胞,优化RNAi实验所需转染试剂计量和siRNA浓度。发现采用Lipofectamine2000计量(1.0μ1)与siRNA浓度(50pmol)能达到约75%的转染效率。针对鸭TLR7基因设计并合成了3对siRNA (siRNA500、siRNA1681、siRNA2957)分别进行RNAi试验,采用SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测TLR7mRNA表达量,比较其抑制率,筛选能有效抑制TLR7表达的siRNA。结果表明：siRNA1681能有效沉默巨噬细胞内鸭TLR7基因mRNA的表达,使TLR7mRNA表达量减少了约71%,符合siRNA转染后应干扰70%mRNA表达水平的标准。采用siRNA1681沉默TLR7基因表达,检测在DHV-Ⅰ感染鸭巨噬细胞24h后TLR7、MyD88、NF-κB、IL-6和IFN-α mRNA相对表达量,发现TLR7、MyD88、NF-κB、 IFN-α和IL-6mRNA表达量显著下调,而未沉默TLR7表达的组在DHV-Ⅰ感染后仍能上调TLR7、MyD88、NF-κB、IL-6和IFN-α mRNA表达量,提示本试验DHV-Ⅰ感染鸭巨噬细胞后通过TLR7依赖MyD88信号通路途径传递免疫信息。