论文部分内容阅读
背景与目的人类内源性逆转录病毒(Human endogenous retroviruses, HERVs)是几百万年前整合到人类基因组中,并以孟德尔方式遗传至今的逆转录病毒的残余物,约占整个基因组的8%。大部分HERVs在进化过程中由于突变、缺失等的积累,已丧失编码能力,但仍有少数HERVs的开放阅读框(Open reading frames, ORFs)被完整保留了下来。这些完整的ORFs可以编码逆转录病毒的蛋白,在一些特定的组织或分化发育的特定阶段表达,可能具有重要的生理意义,而在某些疾病情况下的异常表达提示其可能与疾病的发生发展相关。HERVs基因表达已被证实与多种神经精神疾病相关,如多发性硬化(multiple sclerosis, MS)和精神分裂症(schizophrenia),研究证实病人组织液和血清中含有多发性硬化相关逆转录病毒(Multiple sclerosis associated retrovirus, MSRV)和HERV-K基因表达。Oluwole等应用实时PCR技术检测了运动神经元病(motor neuron disease, MND)萎缩肌肉、未萎缩肌肉及正常对照肌肉组织中ERVWE1 env基因的表达,结果显示萎缩肌肉组织中ERVWE1 env mRNA水平比正常对照肌肉组织显著增高,比未萎缩肌肉组织也有增高。他们还检测了MND肌肉组织中SOD1基因的mRNA水平,结果显示在MND萎缩肌肉组织中SOD1 mRNA水平比未受累肌肉组织及健康对照明显增高,提示MND病变肌肉组织内存在过氧化损伤,支持syncytin的表达与氧化应激损伤具有相关性的观点。Oluwole等在国际上首次报道了MND组织中ERVWE1 env基因的异常转录,但其与MND可能的相关性及意义仍待进一步研究。本研究拟构建syncytin真核表达质粒,并通过脂质体法转染宫颈癌细胞株(Hela),并且采用RT-PCR检测syncytin mRNA水平。为进一步探讨ERVWE1 env基因的异常表达对运动神经元的损伤作用及机制奠定基础。方法①syncytin基因编码区的克隆：选取人胎盘组织提取总RNA,根据人syncytin基因编码区序列(核苷酸库中的编号：AF072506.2)设计引物,应用RT-PCR方法扩增人syncytin基因编码区全长,PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定大小。②syncytin基因真核表达质粒的构建：PCR产物与pCMV-tag 2B空载质粒经限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ酶切纯化后,确定连接反应体系,在T4连接酶作用下,室温5分钟快速连接。将连接产物转化Trans1-T1 phage Resisitant化学感受态细胞细胞,并接种于Ka+抗性琼脂培养皿,挑取阳性重组子。③重组质粒的鉴定：取阳性克隆菌液,进行直接菌液PCR法鉴定,然后对初步鉴定为阳性克隆的菌液提取质粒,应用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ进行质粒的双酶切鉴定,并通过测序进一步鉴定。④转染人宫颈癌细胞株(Hela):转染前一天,以3×105个细胞/孔接种于6孔细胞培养板中,培养于无抗生素的生长培养基中,待细胞生长至80%细胞融合时转染,转染方法按Invitrogen公司提供的Lipofectamine 2000说明书进行。转染分两组,分别转染重组质粒pCMV-tag 2B-syncytin与空载体pCMV-tag 2B,转染后的细胞于37℃,5%CO2条件下培养。⑤检测人宫颈癌细胞(Hela) syncytin mRNA水平：提取Hela细胞总RNA,在M-MLV逆转录酶作用下,逆转录合成cDNA,再以逆转录合成的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR检测,以β-actin作为为内参。结果①成功从人胎盘组织克隆了人syncytin基因编码区全长。②成功构建syncytin基因真核表达载体pCMV-tag 2B-syncytin,分别采用PCR及酶切鉴定,可得到相应大小的目的条带。③插入pCMV-tag 2B载体的syncytin基因序列分析与Genebank syncytin基因序列符合率为99%,不匹配碱基经遗传密码子表比对,均编码同一氨基酸。④重组质粒pCMV-tag 2B-syncytin转染至人宫颈癌细胞(Hela),实时荧光定量PCR检测syncytin mRNA水平,转染重组质粒pCMV-tag 2B-syncytin基因组syncytin mRNA水平比转染空载质粒pCMV-tag 2B组显著增高(P<0.01),表明重组质粒pCMV-tag 2B-syncytin能成功转染入人宫颈癌细胞中并有效表达。结论成功构建了syncytin基因的真核表达质粒pCMV-tag 2B-syncytin,为进一步探讨syncytin的异常表达对运动神经元的可能损伤作用及机制奠定坚实基础。