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目的:糖尿病周围血管病变的病理改变为动脉粥样硬化,患者患病率高、发病年龄早、病情进展快,常伴多器官同时受累较多。内皮细胞受损是糖尿病血管病变的始动因子之一,内皮细胞分泌多种细胞因子,通过复杂的机制调节管壁的通透性及血管张力,血管的形成和重塑亦受内皮细胞产生的细胞外基质蛋白的影响。糖尿病下肢血管缺血性病变患者在应用动脉介入治疗后,取得明显疗效,但是,由于介入治疗引起的内膜损伤也成为术后再狭窄的主要原因之一,如何预防介入治疗后再狭窄成为亟待解决的问题。本研究旨在:1通过球囊扩张术制备兔后肢动脉内膜损伤模型,损伤动脉内膜局部行人脐血干细胞移植。2通过监测移植前后血管内皮生长因子(VEGF)、内皮素(ET-1)、一氧化氮(NO)水平的变化,观察人脐血干细胞(HUCBSC)移植对内皮功能的影响。3通过损伤动脉内膜病理变化观察人脐血干细胞移植对动脉内膜的修复作用,探讨脐血干细胞移植对介入治疗后再狭窄的预防作用。方法:实验对象新西兰大白兔18只,由河北医科大学第四医院实验动物中心提供,为清洁级,雄性,体重2.1±0.5Kg。随机分为三组,每组6只,正常对照组(A组),只行兔左侧股动脉分离术;球囊损伤组(B组),单纯行左侧股动脉球囊扩张、牵拉,造成动脉内膜损伤;球囊损伤后人脐血干细胞移植组(C组),于球囊损伤左侧股动脉后行人脐血干细胞移植,同时A组和B组注射等量的PBS缓冲液作为对照,术毕均予缝合伤口,青霉素钠(160万U/次,2次/日)肌肉注射抗感染,连用3d,肝素钠注射液(200U/Kg.d)连用3d。各组动物于术前及干预后1周、4周采集外周血,用ELISA法测定VEGF的水平、ET-1的水平,血浆NO采用硝酸还原酶法测定;术后4周所有动物处死前取左侧股动脉,行HE染色观察内膜修复情况。1人脐血干细胞(HUCBSC)的采集、分离、制备人脐血来源于足月分娩健康产妇,采集新鲜脐血(6h内用完),先用PBS液等倍数稀释后放置于离心管(50ml)中,按1:1配比加入至人淋巴细胞分离液上,4℃保存,8cm离心半径,每分钟2000转,离心20分钟后,脐血分成5层,单个核细胞在中间白膜层,此时用移液器在中间白膜层小心吸取含单个核细胞的混悬液,放入另一个离心管中,4℃,8cm离心半径,每分钟1000转,离心15分钟,PBS液洗涤3次。最后用低糖DMEM培养液悬浮,细胞浓度计数为5×105/ml.人脐血干细胞混悬液采集、分离、制备成功。2兔股动脉球囊损伤模型制备从兔耳缘静脉注入3%戊巴比妥钠2ml/kg麻醉,术中肝素200u/kg抗凝,于左侧腹股沟韧带至膝关节上下纵行切开,分离左侧股动脉,夹闭近端、远端血管,于近心端进行股动脉穿刺,A组:仅行左侧后肢股动脉分离术;B组、C组行股动脉穿刺后把3.0-40mm球囊缓慢送入至股动脉,给12个大气压充盈球囊,保持3分钟,间歇1分钟后重复上述操作,共操作3次,同时牵拉球囊,以制成兔左后肢股动脉球囊损伤模型。3球囊损伤后人脐血干细胞移植术B、C两组球囊损伤兔左后肢股动脉模型制备成功后,恢复股动脉血流3分钟,夹闭A、B、C三组分离的股动脉远端,A、B组于夹闭股动脉近端处注入0.5ml PBS缓冲液,C组在夹闭股动脉近端处注入已制备好的人脐血干细胞混悬液0.5ml。注射完毕后,三组分离的股动脉近端均用血管夹夹闭30分钟,让移植的干细胞充分归巢,手术缝合伤口,使股动脉恢复血流。肝素(200U/kg.d),抗凝3天。4移植前后血管内皮生长因子(VEGF)、内皮素(ET-1)、一氧化氮(NO)水平的测定A、B、C三组术前、术后1周、术后4周均采外周血5ml,枸橼酸钠抗凝,分离血浆备用。VEGF、ET-1测定采用ELISA法,单位:μg/L。血浆一氧化氮(NO)测定采用硝酸还原酶法测定,单位:umol/L。5损伤血管内膜修复的观察移植后4周,常规方法制备兔损伤血管光镜组织切片,行苏木素-伊红(HE)染色,采集图像,观察损伤血管内膜修复情况。应用SPSS14.0统计学软件进行数据统计,计量资料以(?)±s表示,组间、组内比较采用方差分析(F检验),以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1实验动物观察A、B、C三组动物术后伤口逐渐愈合,无糜烂溃疡,活动能力正常,所有动物在处死取材时,局部均无坏疽,所有动物中途无因故退出。2 VEGF水平测定结果术前,A、B、C三组VEGF水平差异无统计学意义(P>0.05);术后1周,C组VEGF水平升高,高于B组和A组,差异具有统计学意义(P<0.05),B组VEGF水平高于A组,差异有统计学意义(P<0.05);术后4周,C组VEGF水平仍高于B组和A组,差异有统计学意义(P<0.05),B组VEGF水平高于A组,差异有统计学意义(P<0.05)。A组组内VEGF水平术前、术后1周、术后4周差异无统计学意义(P>0.05);B组组内VEGF水平术后4周高于术前、术后1周,术后1周高于术前,差异有统计学意义(P<0.05);C组组内VEGF水平术后1周高于术前、术后4周,差异有统计学意义(P<0.05),术后4周高于术前,差异有统计学意义(P<0.05)。3 ET-1和血浆NO水平的变化A、B、C三组术前ET-1水平差异无统计学意义(P>0.05);术后1周,C组ET-1水平低于A、B两组,差异有统计学意义(P<0.05),B组ET-1水平低于A组,差异有统计学意义(P<0.05);术后4周C组ET-1水平均低于于A、B两组,差异有统计学意义(P<0.05),B组ET-1水平低于A组,差异有统计学意义(P<0.05)。A组组内ET-1水平术前、术后1周、术后4周差异无统计学意义(P>0.05);B组组内ET-1水平术前、术后1周、术后4周两两比较均有差异(P<0.05);C组组内ET-1水平术前与术后4周无差异,术后4周低于术后1周,差异有统计学意义(P<0.05)。A、B、C三组术前NO水平差异无统计学意义(P>0.05);术后1周,C组NO水平高于A、B两组,差异有统计学意义(P<0.05),A、B两组NO水平差异不显著;术后4周,C组NO水平高于A、B两组,差异有统计学意义(P<0.05),A、B两组NO水平差异不显著。C组术后4周较术前、术后1周均有升高,差异有统计学意义(P<0.05)。A组组内NO水平术前、术后1周、术后4周差异无统计学意义(P>0.05);B组组内NO水平术前高于术后1周、术后4周,差异有统计学意义(P<0.05),术后1周NO水平高于术后4周,差异有统计学意义(P<0.05);C组组内NO水平术后4周较术前、术后1周均有升高,差异有统计学意义(P<0.05),术前高于术后1周,差异有统计学意义(P<0.05)。4股动脉内膜修复的观察术后4周,C组动物股动脉有轻度内膜中断和增生,弹力膜轻度断裂,B组动物股动脉内膜连续性中断,内膜增生明显,弹力膜断裂明显;A组动物股动脉内膜完整,弹力膜连续,无断裂。结论:1本实验通过球囊扩张并阻断血流建立兔左后肢股动脉缺血损伤模型。2人脐血干细胞移植可能促进兔模型血清VEGF分泌,诱导血管形成,增强内皮细胞的修复能力。3人脐血干细胞移植后有助于兔模型血清NO的升高,ET-1水平降低,从而减轻血管收缩程度,促进兔受损动脉内膜的再内皮化,改善内皮功能,预防血管再狭窄的发生。4人脐血干细胞移植可能修复兔受损血管内膜。