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肝癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，且近年来其发病率和死亡率均呈上升趋势，由于一直缺少有效的药物和治疗手段，临床中很难取得满意的治疗效果。因此，肝癌特效药物的研究将可极大提高肝癌患者的生存期和生存质量，这也是国家多次五年计划中治疗重大疾病新药创制的重点方向。灵芝免疫调节蛋白（Ling Zhi-8，LZ-8）是一种从赤灵芝（Ganodermalucidium）菌丝体中提取出的真菌免疫调节蛋白。在抗肿瘤研究中，我们发现rLZ-8具有大量进入并杀伤肿瘤细胞的功能，同时对正常组织细胞却无杀伤作用。论文作者所在课题组已有大量研究表明进入肿瘤细胞是rLZ-8执行抗肿瘤作用的先决条件，因此，明确rLZ-8的入胞机制在rLZ-8的抗肿瘤研究中至关重要。本论文根据天然LZ-8的氨基酸序列及毕赤酵母的密码子偏好性，将LZ-8基因进行了密码子优化，合成目的基因并构建pGAPZα A-rLZ-8重组质粒，通过电转化法将目的基因整合到组成型表达载体X-33酵母基因组中。经Zeocin抗性培养基和PCR、Western Blot鉴定筛选出成功整合并表达rLZ-8的酵母工程菌，表达产物经分离纯化获得了高纯度的rLZ-8，经蛋白质N端测序证明与天然LZ-8一致。在后续研究中，我们通过观察荧光标记的rLZ-8在肝癌细胞HepG2中的定位来进行rLZ-8内吞机制的初步研究。通过选用针对不同细胞内吞途径的化学抑制剂，研究和分析了rLZ-8入胞依赖的内吞途径，并通过siRNA干扰第一轮筛选到的通路中关键基因进行了表达抑制，对细胞内吞的机制进行了进一步确证。主要研究结果如下：1、rLZ-8进入HepG2细胞不依赖网格蛋白介导的内吞途径网格蛋白抑制剂氯丙嗪可阻断网格蛋白介导的内吞途径，但并不影响rLZ-8进入HepG2细胞，提示rLZ-8进入细胞不通过网格蛋白介导的内吞途径。2、rLZ-8进入HepG2细胞不依赖小窝/脂筏介导的内吞途径小窝/脂筏依赖内吞途径抑制剂，即胆固醇抽提剂制菌霉素和孕酮，二者可以去除细胞膜上胆固醇及破坏小窝结构的完整性来抑制小窝/脂筏介导的内吞。实验发现，上述两种抑制剂对rLZ-8的入胞过程均无影响，提示rLZ-8的入胞机制与小窝/脂筏介导的内吞途径无关。3、rLZ-8进入HepG2细胞与Src激酶有关研究发现，经Src激酶特异性抑制剂Genistein处理后，HepG2细胞对rLZ-8的内吞作用受到明显抑制，提示rLZ-8入胞机制与Src激酶有关。为了进一步确证，我们使用siRNA特异性抑制了c-Src蛋白的表达，结果表明rLZ-8的内吞作用受到了显著抑制，证明了rLZ-8的入胞跟Src激酶有关。4、rLZ-8进入HepG2细胞与Src-PI3K信号通路有关系研究发现，经PI3K特异性抑制剂Wortmannin处理后，HepG2细胞对rLZ-8的内吞作用部分受到抑制，且c-Src是PI3K的上游分子，提示rLZ-8入胞机制可能与Src-PI3K通路有关系。综上所述，本文利用组成型毕赤酵母表达系统成功表达了rLZ-8，并得到了高纯度和具有稳定生物活性的rLZ-8。在rLZ-8内吞机制的研究中，发现rLZ-8进入HepG2细胞与经典的网格蛋白和小窝/脂筏依赖内吞途径无关，与Src激酶和Src-PI3K通路有关，具体的调控机制有待进一步研究确认。对rLZ-8进入HepG2细胞中所涉及的途径和调控机制的进行初步筛选，有利于深入研究和阐明rLZ-8的抗肿瘤机理，并为其作为抗肝癌新药的研发奠定了理论基础。