【摘 要】
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抗体在疾病的诊断、治疗和预防中发挥着重要的作用,其生产制备在经历了多抗血清和单克隆抗体(Monoclonal antibodies,McAb)阶段,现在已步入了基因工程抗体的时代.单链抗体(si
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抗体在疾病的诊断、治疗和预防中发挥着重要的作用,其生产制备在经历了多抗血清和单克隆抗体(Monoclonal antibodies,McAb)阶段,现在已步入了基因工程抗体的时代.单链抗体(single chain Fv,ScFv)作为一个重要的基因工程抗体,是利用基因工程方法使抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过一段约5-25个aa的连接肽,首尾拼接而形成的重组蛋白,具有分子量小、组织穿透力强、体内清除快、免疫原性低、易于大肠杆菌发酵生产和进行基因工程改进等优点.噬菌体显示技术利用噬菌体cpⅢ或cpⅧ衣壳蛋白的N端插入单链抗体基因,形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的膜表面,使噬菌体表面表达异源性蛋白分子,经筛选后获得特异性抗体.五步蛇是中国南方引起蛇伤的常见毒蛇品种之一,又称尖吻腹、蕲蛇、五步龙等,研制抗该毒素的ScFv对于预防和治疗毒蛇咬伤而引发的毒素中毒具有重要的应用价值. 该文选用五步蛇毒配成福氏完全佐剂免疫5周龄的Balb/c雌鼠,经三次免疫后用ELISA法测定抗体效价,挑选其中效价滴度最高的三只小鼠提取脾脏组织,抽提细胞总RNA,经RT-PCR分别扩增出VH、VL基因片段,再经Linker连接成ScFv基因(single chain variable fragment).ScFv基因与pCANTAB 5E载体分别经Sfi Ⅰ、Not Ⅰ酶切后,目的基因通过T4 DNA连接酶连接重组至载体,并通过CaCl<,2>法转化至大肠杆菌TG1中进行表达,经辅助噬菌体(Helper phage)M13K07拯救后建成抗五步蛇毒的特异性噬菌体展示文库.经过4轮吸附-洗脱-富集筛选后,从该库中随机挑取53个克隆进行ELISA检测,结果得到10个阳性克隆,阳性率为18.9％.对其中信号最强的2个单克隆做Western blot免疫印迹分析,结果均有一条单一的特异性条带,所中和的蛇毒蛋白成份分子量约为18.4KDa.通过实验,利用噬菌体展示库技术成功制备出与五步蛇毒的单一蛋白成份发生结合的特异性ScFv抗体,无任何交叉反应.为进一步构建高效表达系统,制备出能高效表达的ScFv抗体奠定了基础. 该研究用目标抗原免疫Balb/c小鼠后,构建成特异性的抗体库,再进行筛选.和利用非特异性抗体展示库中筛选特异性抗体比较,这种方法大大提高了获得特异性抗体的机率.利用噬菌体展示文库技术筛选抗体比通常的细胞融合技术制备单克隆抗体快速、方便. 该研究在制备抗五步蛇毒单链抗体的同时,在该实验室建立了利用噬菌体展示文库技术筛选单链抗体的完整技术体系,为该技术的广泛应用奠定了良好的基础.
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