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乙酸酯作为白酒香气的物质基础,其含量和比例对酒的风味协调性和酒质产生重要影响。乙酸酯主要是生长活动期的细胞在醇乙酰基转移酶等酯合成酶的催化下生成,ATF1编码的醇乙酰基转移酶的活性越高,菌株合成乙酸酯的能力越强,有研究表明,腺苷酸环化酶编码基因CYR1受损的细胞通过提高耐热性和耐氧化胁迫而延长生存时间。本研究从提高乙酸酯合成酶的活性和延长细胞时序寿命两方面着手调控乙酸酯的合成,分别改造ATF1基因和CYR1基因的启动子,达到了提高乙酸酯含量的目的。重组菌株无异源基因的残留,提高了工程菌株的安全性。主要研究内容如下:(1)建立了一种目的片段无缝插入方法,通过该方法将强启动子PGK1P精确插入到ATF1基因ORF(Open Reading Frame)的5’端,实现基因的过表达调控,促进乙酸酯的合成。测序结果显示无任何外源基因的残留。重组菌株AY15a-P中ATF1的转录水平是出发菌株的39.4倍,醇乙酰基转移酶活力是出发菌株的5倍。玉米原料液态发酵结果显示,强启动子PGK1p无缝插入后,菌株基本发酵性能保持不变,各种乙酸酯的量有不同程度的提高,其中乙酸乙酯的量由25.04 mg/L提高为78.76 mg/L。(2)弱化CYR基因的表达促进乙酸酯的合成,利用无痕敲除方法分别敲除CYR1基因启动子3’端的60、90和120 bp序列。RT-qPCR结果显示,敲除60和90 bp菌株基因的转录水平基本一致,为出发菌株的72%,敲除120 bp菌株CYR1的转录水平大幅下降,为出发菌株的32%。耐热性实验和时序寿命测定结果均显示,敲除120 bp菌株效果最好。玉米原料液态发酵结果显示,重组菌株在保持基本发酵性能不变的情况下,总酯的量有不同程度提高。气相色谱检测结果显示敲除120 bp菌株乙酸乙酯的量为出发菌株的1.24倍,异戊醇的量下降了 20%。