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研究目的本课题运用免疫组化等分子生物学实验方法结合生物信息学分析研究转录因子Sp1在胰腺癌中表达水平;探讨其与患者临床特征的关系;阐明Sp1在胰腺癌生物学中的功能及相关机制。研究内容和方法1.探讨Sp1在胰腺癌中表达水平及功能。通过免疫组化和生物信息学分析阐明胰腺癌Sp1表达水平;分析Sp1表达水平与患者临床病理特征的关系;继而通过蛋白印迹等实验方法,初步明确Sp1在胰腺癌中的功能。2.探讨Sp1在胰腺癌血管新生中的功能及机制。通过免疫组化、慢病毒转染、蛋白印迹等分子细胞实验方法及生物信息学分析,检测COX-2在胰腺癌中表达,分析其与Sp1的关系;采用荧光素梅报告基因检测及染色质免疫沉淀等方法,完善Sp1和COX-2相关的机制;构建COX-2干扰细胞系,利用平板克隆、细胞侵袭和官腔形成实验等实验方法,阐明COX-2在胰腺癌血管新生中的功能;利用蛋白印迹、RNA干扰及药物抑制等实验技术,明确EGFR-p38/MAPK信号通路调控胰腺癌血管新生机制。3.探讨胰腺癌Sp1极化M2巨噬细胞促进胰腺癌进展的机制。通过免疫组化、共培养、Elisa等分子生物学实验明确胰腺癌Sp1表达水平与间质M2巨噬细胞浸润的关系;利用蛋白印迹、RNA干扰、Elisa等实验方法,明确胰腺癌Sp1介导M2巨噬细胞极化的机制;最后,利用人细胞因子定量抗体芯片-9000筛选潜在的、Sp1调控的促进M2巨噬细胞极化的细胞因子。研究结果1.免疫组化和生物信息学分析显示胰腺癌高表达Sp1;统计分析指出,Sp1与患者淋巴结分期、总生存期相关,是影响患者预后的独立因素;蛋白印迹、平板克隆以及划痕等实验显示胰腺癌细胞系高表达Sp1,与胰腺癌细胞增殖、侵袭相关。2.免疫组化、慢病毒转染、蛋白印迹及生物信息学分析等实验发现胰腺癌高表达的COX-2与Sp1正相关;荧光素梅报告基因检测及染色质免疫沉淀等方法证实Sp1可转录激活COX-2,上调其表达;平板克隆、细胞侵袭和官腔形成实验等实验显示胰腺癌COX-2可促进血管内皮细胞增殖、侵袭以及管腔形成,进而促进胰腺癌血管新生;蛋白印迹、RNA干扰及药物抑制等实验方法显示EGFR-p38/MAPK信号通路可磷酸化Sp1,继而上调COX-2、VEGF表达促进血管新生。3.免疫组化、共培养、Elisa等分子生物学实验显示胰腺癌中大量浸润M2巨噬细胞,且与胰腺癌Sp1表达水平正相关;蛋白印迹、RNA干扰、Elisa等实验方法提示胰腺癌Sp1调控的活性介质可活化巨噬细胞p38/MAPK信号通路,介导其向M2巨噬细胞极化;最后,通过人细胞因子定量抗体芯片-9000,我们发现胰腺癌Sp1干扰后有52个细胞因子上调两倍以上,26个细胞因子下调2倍以上。研究结论高表达的Sp1可显著上调胰腺癌细胞的恶性表型,如可增强胰腺癌细胞的增殖和侵袭、促进促进血管新、促进M2巨噬细胞极化等。上述研究结果提示,化疗联合靶向抑制Sp1或是胰腺癌治疗的新选择。