稻瘟病是水稻的重大病害之一,属于真菌病害。它发生于全世界各个水稻产区,其中以亚洲和非洲等主要稻区发病较为严重。在中国遍及各个稻区,一般山区重于平原,粳稻重于籼稻。稻瘟病发病时,水稻产量严重减产,甚至绝收。因此,防治稻瘟病一直以来是育种家和病理学家研究的热点。目前,虽然防治稻瘟病的方法多样,但选育抗病品种较其它各种防治方法,具有效果稳定、安全和无公害等特点,是防治水稻稻瘟病的一条合理、高效和长远的方法。而挖掘稻瘟病抗病相关基因是选育抗稻瘟病品种的基础。近年来,随着测序技术和芯片技术等方面的发展,为发掘有效的稻瘟病抗病相关基因提供了坚实的基础。本研究中,利用稻瘟病感病材料丽江新团黑谷(丽江)和抗病材料地谷,在接种稻瘟病菌20 h时分别提取叶片RNA,利用芯片技术筛选出在抗感材料间差异表达的基因。在差异表达的基因中,筛选到了一个在丽江中显著受稻瘟病菌诱导而在地谷中表达变化不显著的基因。通过SMART软件分析它的蛋白质结构,发现其含有两个C2H2型锌指结构,我们将此基因命名为ZFP3。因为ZFP3在感病材料中受稻瘟病菌的诱导,因此,推测ZFP3是一个水稻抗稻瘟病的负调控因子。为了验证这一假设,我们构建了基因ZFP3干涉的载体,并将其进行转化到水稻材料台北309中,通过病理学、细胞学和分子生物学等手段揭示ZFP3在水稻与稻瘟病菌互作过程中扮演的角色。研究结果如下：1、基于芯片数据,筛选到一个在丽江接菌后显著上调表达,而在地谷中无显著变化的C2H2型锌指蛋白基因ZFP3,并通过荧光定量PCR技术(qRT-PCR)证实了ZFP3在芯片数据中的表达模式是正确的。2、通过亚细胞定位实验,发现ZFP3定位于水稻原生质的细胞核中。通过酵母单杂交技术(Yeast one-hybrid)实验,发现ZFP3蛋白能结合C2H2型转录因子特异结合序列EP1S。由此表明ZFP3是一个转录因子。3、在RGAP (Rice Gnome Annotation Project)数据库中获得基因ZFP3的CDS序列,通过序列Blast,选取了ZFP3特异的片段作为基因ZFP3的目标干涉片段,构建了基因ZFP3的干涉载体,以台北309为遗传背景,通过遗传转化将ZFP3的干涉载体转化到台北309中,成功获得了干涉ZFP3的转基因阳性株系。4、在转基因阳性株系T2代中筛选到ZFP3基因于涉的纯合株系,然后利用qRT-PCR检测ZFP3的干涉程度,结果获得两个干涉显著的转基因株系。5、通过病理学实验,发现ZFP3两个显著干涉的转基因株系(ZFP3Ri2和ZFP3Ri4)叶片上的病斑小于对照TP309叶片上的病斑。同时,利用qRT-PCR技术检测发现转基因株系叶片上稻瘟病数量显著少于对照TP309叶片上的,表明ZFP3是一个水稻抗稻瘟病的负调控因子。6、将稻瘟病菌注射在叶鞘内,通过显微镜观察,发现基因ZFP3被干涉后,稻瘟病菌的附着孢发育迟缓。同时,发现当稻瘟病菌菌丝侵入水稻细胞后,基因ZFP3被干涉的水稻细胞能快速产生过敏反应,从而加速细胞死亡,以此阻止菌丝向邻近细胞蔓延。7、通过DAB染色,发现在稻瘟病菌附着胞的位置,基因ZFP3被干涉的转基因植株叶片上的过氧化氢积累比对照TP309叶片上的多。通过qRT-PCR检测,发现基因ZFP3能够正向调控活性氧降解相关基因的表达。当基因ZFP3的表达被干涉后,降解过氧化氢的基因的表达量也降低了,从而引起过氧化氢的积累,进而引发过敏反应。8、水杨酸(Salicylic Acid, SA)与植物抗病相关,因此,我们也检测了转基因株系和对照材料TP309中SA合成和信号传导的相关基因的表达量,结果发现基因ZFP3干涉后,SA合成和信号传导相关的部分基因的表达量升高了,表明ZFP3负调控SA合成和信号传导的相关基因。因此,当ZFP3被干涉后,水稻产生了稻瘟病抗性。综上所述,基因ZFP3通过负调控SA合成和信号转导的相关基因的表达,而正调控过氧化氢降解相关基因的表达,从而引起稻瘟病菌侵染水稻叶片位点处过氧化氢量的变化,以此影响稻瘟病菌附着胞发育进程和侵入菌丝的扩展,进而使水稻产生抗感稻瘟病的差异。