实验目的： 1.分别构建、制备携带外源性hVEGF165基因和靶向内源性VEGF基因短发夹环结构双链RNA(ShortHairpinRNA，shRNA)片段的2型重组腺相关病毒载体(RecombinantAdeno-associatedViralVector，rAAV)，为后续研究提供实验工具。 2.观察缺血性脑损伤后海马齿状回神经前体细胞增殖的时空规律，以及齿状回新生细胞的迁移和功能特点。 3.探讨缺血性脑损伤后海马内源性VEGF表达的时间和空间分布特点. 4.探讨在海马导入外源性hVEGF165基因对缺血性脑损伤后海马齿状回神经发生的影响 实验方法： 第一部分：携带hVEGF165基因和靶向内源性VEGF基因shRNA的重组腺相关病毒载体的构建和制备 1.通过基因克隆技术构建携带hVEGF165基因的2型rAAV(rAAV2)包装质粒pSNAV2.0-hVEGF165-IRES-EGFP，并进行酶切鉴定； 2.根据鼠源VEGF基因(NM031836)CDS区编码序列设计、选择三段19nt的寡核苷酸序列作为靶向内源性VEGF基因的shRNA片段序列，并以此合成三对长引物单链DNA片段，经退火、双酶切后与同样双酶切的质粒pDC316-EGFP-U6连接、转化，获得三个质粒； 3.将获得的质粒分别转染BHK细胞，以RealTimePCR和Westernblot方法筛选 4.通过一种辅助病毒感染一个载体细胞株的策略，分别制备rAAV2-hVEGF165-IRES-EGFP和rAAV2-EGFP-U6-shRNA(VEGF)病毒载体。 第二部分：脑缺血后大鼠海马齿状回神经前体细胞增殖、分化及新生细胞功能的研究 1.采用不同剂量BrdU经腹腔注射入大鼠体内，应用免疫组织化学方法确定BrdlJ标记大鼠海马齿状回新生细胞的最佳BrdU给药剂量； 2.利用4-VO(FourVesselOcclusion)法建立大鼠全脑缺血再灌注损伤模型，于缺血性脑损伤后不同时间点经腹腔注射BrdU. 3.利用免疫组织化学和双标记、三标记免疫组织荧光化学方法观察缺血性脑损伤后齿状回新生细胞迁移、分化及功能特点。 第三部分：内源性VEGF基因在脑缺血后大鼠海马齿状回神经发生中的作用及机制研究 1.首先采用RealTimePCR方法和免疫组织化学、免疫组织荧光化学方法对缺血性脑损伤后海马内源性VEGFmRNA、齿状回VEGF蛋白表达的时空特点以及齿状回微血管密度(MicrovesselDensity，MVD)的变化进行观察； 2.将rAAV2-EGFP-U6-shRNA(VEGF)立体定向微量注射给药至大鼠右侧海马齿状回，观察其对缺血性脑损伤后不同时间点海马内源性VEGFmRNA水平、齿状回VEGF蛋白表达、齿状回微血管密度、齿状回神经前体细胞增殖水平及齿状回新生细胞迁移的影响。 第四部分：重组腺相关病毒载体介导外源性VEGF基因表达对脑缺血后大鼠海马齿状回神经发生的影响 1.将携带hVEGF165基因的rAAV2载体立体定向微量注射给药至大鼠右侧海马齿状回，2w后建立大鼠脑缺血模型，采用RealTimePCR方法观察其对缺血性脑损伤后不同时间点右侧海马hVEGF165mRNA水平的影响； 2.采用免疫组织化学和免疫组织荧光化学方法观察比较海马齿状回外源性hVEGFl65基因长期表达对缺血性脑损伤后不同时间点齿状回VEGF蛋白表达、齿状回MVD及齿状回神经发生的影响。 实验结果： 第一部分：携带hVEGF165基因和靶向内源性VEGF基因shRNA的重组腺相关病毒载体的构建和制备 1.鉴定结果显示构建的病毒包装质粒pSNAV2.0-hVEGF165-IRES-EGFP构建正确。 2.鉴定结果显示构建的3个携带靶向鼠内源性VEGF基因shRNA片段的质粒构建正确，均携带有启动EGFP转录的CMV启动子和启动shRNA序列转录的U6启动子。 3.制备的两株病毒载体rAAV2-hVEGF165-IRES-EGFP和rAAV2-EGFP-U6-shRNA(VEGF)经鉴定和质量检测，结果显示构建、包装准确，纯度好，感染细胞效率高。 第二部分：脑缺血后大鼠海马齿状回神经前体细胞增殖、分化及新生细胞功能的研究 1.BrdU腹腔给药剂量为10mg/kg组大鼠齿状回BrdU阳性细胞数与50mg/kg、100mg/kg剂量组均有显著性差异 2.大鼠脑缺血后3d时，齿状回BrdU阳性细胞数量较对照组增多(P<0.05)，并于缺血后第6d时达到高峰(P<0.01)，缺血后第48d时恢复至正常水平(P>0.05)。 3.缺血性脑损伤大鼠齿状回新生细胞(BrdU阳性细胞)存活4w后大多呈单个散在分布状态. 第三部分：内源性VEGF基因在脑缺血后大鼠海马齿状回神经发生中的作用及机制研究 1.缺血性脑损伤后海马VEGFmRNA表达水平反应性升高，缺血后24hr达到峰值，与正常对照组和其它各时间点大鼠相比差异均有显著性意义(P<0.05)；其后海马VEGFmRNA水平开始逐渐下降，于缺血后第12d回落至正常水平(P>0.05)。 2.免疫组织化学染色结果显示缺血性脑损伤后可见VEGF蛋白少量表达，24hr海马VEGF蛋白强阳性表达，12d时仅有弱表达；缺血性脑损伤后VEGF蛋白在海马区的表达主要集中于海马齿状回。 3.免疫组织化学染色结果显示正常对照组大鼠海马区仅有CD34抗原(MVD指标)呈条索状弱阳性表达 4.rAAV2-EGFP-U6-shRNA(VEGF)立体定向微量注射给药至大鼠右侧海马齿状回，2w后制作缺血性脑损伤动物模型。 5.RealTimePCR分析结果 6.免疫组织化学染色结果 7.免疫组织化学染色结果 第四部分：重组腺相关病毒载体介导外源性VEGF基因表达对脑缺血后大鼠海马齿状回神经发生的影响 1.RealTimePCR检测结果；免疫组织化学染色结果。 2.免疫组织化学染色结果 3.导入外源性hVEGF165基因大鼠缺血性脑损伤后6d和24hr时，其右侧海马齿状回BrdU阳性细胞数均显著高于同时间点缺血性脑损伤大鼠(P<0.05)。 结论： 1.本课题中制备的两株病毒载体rAAV2-hVEGF165-IRES-EGFP和rAAV2-EGFP-U6-shRNA(VEGF)，构建、包装准确，纯度好，感染细胞效率高。 2.采用立体定向技术将制备的两株病毒载体微量注射给药至海马齿状回后可以在该区域高效、稳定和持续的表达外源性hVEGF165或剔降内源性VEGF基因表达。 3.2型rAAV是一种合适的中枢神经系统基因导入载体，利用病毒载体实现RNAi是在中枢神经系统进行功能基因鉴定的有效研究手段。 4.50mg/kg以上剂量的BrdU腹腔注射给药可较为理想的标记海马齿状回新生细胞。 5.缺血性脑损伤可诱导海马齿状回神经前体细胞增殖水平在一定时间窗(3d～24d)内上调。 6.缺血性脑损伤后海马齿状回新生细胞可迁移入颗粒细胞层，并具备原有功能性颗粒细胞同样的形态学特点，合成并表达神经活性递质。 7.缺血性脑损伤后迁移入颗粒细胞层的海马齿状回新生细胞可与其周围的颗粒细胞一样，在病理性刺激下同时被迅速激活。 8.缺血性脑损伤后，海马内源性VEGF基因表达水平反应性上调促进缺血诱导的齿状回神经发生和齿状回新生血管形成。 9.不同细胞来源的VEGF在缺血性脑损伤后海马齿状回神经发生过程中发挥了不同的作用。 10.缺血性脑损伤后与内源性VEGF基因表达水平变化相关的新生血管形成主要参与了缺血性脑损伤后齿状回新生细胞的分化和迁移过程，并在其中发挥对新生细胞的支持、营养和迁移导向作用。 11.缺血性脑损伤后，不同细胞来源的。 12.海马齿状回导入外源性hVEGF165基因可促进缺血性脑损伤诱导的齿状回神经发生水平上调。 本课题的主要创新点： 1.从分子和基因水平全面、系统的探讨了海马内源性VEGF基因表达在缺血性脑损伤后海马齿状回神经发生中的作用及相关机制； 2.从基因治疗的角度探讨了导入外源性VEGF基因对缺血性脑损伤后涉及海马结构和功能重塑相关神经生物学事件的影响及治疗意义，为以VEGF基因为靶点进行缺血性脑血管病基因治疗研究和VEGF基因治疗产品最终进入缺血性脑血管病临床治疗提供了不可或缺的实验数据； 3.为在中枢神经系统利用病毒基因载体通过RNA干扰(RNAinterference，RNAi)封闭内源性基因表达和介导外源性基因转移的技术手段进行功能基因鉴定和开展神经系统疾病基因治疗研究提供了通用的材料、手段与研究策略； 4.采用形态学研究手段，探讨了缺血性脑损伤后齿状回新生神经元的功能特点。