宫颈癌是危及全球妇女健康的严重疾病,在世界范围内发病率居女性恶性肿瘤第二位。宫颈刮片的筛查和疾病的治疗给人们带来了巨大的经济负担。大量的流行病学、分子生物学、病毒学和临床研究证实,宫颈癌及癌前病变的发生与高危型人乳头瘤病毒（HumanPapillomavirus,HPV）持续感染密切相关。宫颈癌病人的宫颈样本中可以检测到的HPV高危型别包括HPV16,18,45,31,33,58,52,35,59,56等,其中HPV16的检出率最高,其它高危型别在不同国家和地区检出率不同。我国宫颈癌患者中HPV16感染率最高为61.9%,居第二位和第三位的分别为HPV18（7.7%）和HPV58（6.4%）。因此,研制适用于我国包括HPV16、HPV18、HPV58等主要高危型别的多价治疗性疫苗,对HPV重度感染及相关肿瘤的人群治疗具有重要意义。HPVE6、E7蛋白持续在肿瘤细胞中表达,是形成肿瘤并维持恶性特征所必需的癌蛋白,正常组织中不存在这两种蛋白,因此E6和E7蛋白是目前HPV相关的宫颈癌及癌前病变治疗性疫苗的主要靶抗原。为安全起见,通常以修饰后去除了转化活性但仍保留抗原性的E6和E7蛋白作为靶抗原进行治疗性疫苗的研制。本论文选择我国宫颈癌患者中含括76%高危感染的HPV16、HPV18、HPV58三个型别,采用可诱发机体产生较强细胞免疫的痘苗病毒天坛株作为载体,构建分别表达高危型别HPV16、HPV18、HPV58 ETE6融合蛋白和共表达HPV16/18 ETE6融合蛋白的重组痘苗病毒疫苗,研究这些重组痘苗病毒在单独免疫和联合免疫时的免疫效果,以确定多价重组痘苗病毒疫苗的可行性,为研制能够治疗HPV重度感染或相关肿瘤的多价疫苗提供实验依据。主要研究结果如下:第一、建立了体液免疫反应检测方法,制备了用于重组痘苗病毒鉴定的抗体。用原核表达系统表达并纯化了三个型别的E6、E7蛋白共计六种抗原,使用这些材料建立了用于体液免疫反应检测的ELISA方法。利用纯化后的HPV58型E7、E6蛋白免疫动物制备了相应的多克隆抗体,用于重组痘苗病毒的鉴定。第二、建立了用于评价E6、E7蛋白细胞免疫反应的检测方法,从肽库中筛选到HPV18E6_41-55、HPV18E6_61-75和HPV58E6_57-71三条文献中未报导的新的表位肽序列,做为ELISPOT检测中特异性刺激肽,用于本研究中重组痘苗病毒细胞免疫效果的研究。第三、完成了HPV16、HPV18和HPV58三个型别E6、E7基因的改造和E7E6基因的融合,构建了分别表达HPV18型和HPV58型E7E6融合蛋白的重组痘苗病毒和共表达HPV16/18型E7E6融合蛋白的双价重组痘苗病毒,结果显示双价重组痘苗病毒目的蛋白表达稳定、目的基因丢失率为0～2%。第四、对分别表达HPV16型、HPV18型、HPV58型E7E6融合蛋白的重组痘苗病毒和共表达HPV16/18型E7E6融合蛋白的重组痘苗病毒单独免疫和联合免疫效果进行了评价。1.表达HPV16E6E7融合蛋白的重组痘苗病毒和共表达HPV16/18E7E6融合蛋白的双价重组痘苗病毒免疫小鼠都能产生针对HPV16E7蛋白异性的T细胞免疫反应,明显推迟小鼠成瘤时间,保护30%-40%的小鼠免受TC-1肿瘤细胞攻击。2.表达HPV58E7E6融合蛋白的重组痘苗病毒免疫的小鼠可检测到针对HPV58E6蛋白的特异性T细胞免疫反应,在一定程度上保护小鼠抵抗RMAHPV58E7肿瘤细胞的攻击。3.表达HPV18E7E6融合蛋白的重组痘苗病毒免疫小鼠可产生针对HPV18E6蛋白的特异性T细胞免疫反应,但没有检测到针对HPV18E7蛋白的细胞免疫反应,而在免疫恒河猴后可检测到针HPV18E7蛋白的特异性T细胞免疫反应,提示小鼠可能不适合用于HPV18E7蛋白的评价。4.共表达HPV16/18E7E6融合蛋白的双价重组痘苗病毒能够诱发小鼠产生针对HPV16E7和HPV18E6蛋白的细胞免疫反应,与相应的单价重组痘苗病毒产生的细胞免疫反应水平无明显区别。双价重组痘苗病毒免疫的3只恒河猴中,产生针对HPV18E6、HPV18E7蛋白的特异性T细胞免疫反应的有2只,产生针对HPV16E6、HPV16E7蛋白的特异性T细胞免疫反应的各有1只,其中有一只恒河猴产生了针对四种蛋白的特异性T细胞免疫反应。5.共表达HPV16/18E7E6融合蛋白的双价重组痘苗病毒与表达HPV58E7E6融合蛋白的单价重组痘苗病毒混合成三价疫苗免疫小鼠能够产生针对目的蛋白的抗体和相应的细胞免疫反应,并能延缓相应荷瘤小鼠的肿瘤生长速度,保护部分小鼠免受肿瘤细胞攻击,说明联合免疫很好发挥了双价重组痘苗病毒和单价重组痘苗病毒的免疫效果。本研究结果说明利用重组痘苗病毒进行HPV多价重组痘苗病毒疫苗的研究是可行的,为今后研制用于重度HPV感染及其相关肿瘤治疗的多价疫苗提供了重要的实验室依据。