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透明质酸（hyaluronic acid或hyaluronan,HA）是一种广泛存在于脊椎动物细胞间质和部分细菌荚膜的高分子糖胺聚糖。透明质酸参与许多重要的生物学过程,生物活性与其分子量大小密切相关,特别是低分子量HA寡聚糖具有独特的生物学活性,包括抗肿瘤、促进细胞分化和血管再生等功能,因此在食品保健、化妆品和医疗领域具有重要的应用前景。由于物理和化学降解法的诸多问题而导致产品质量稳定性差,以及酶法催化所需商品化透明质酸酶（hyaluronidase,HAase）的价格昂贵等因素,当前HA寡聚糖难以实现工业化生产制备和广泛应用研究。本论文以酶工程、以代谢工程和合成生物学技术着重于解决HAase的生产和HA寡糖制备所面临的瓶颈问题:在食品级宿主Bacillus subtilis 168构建了高效的的HA异源合成途径;克隆和表征了首个水蛭HAase基因LHyal;实现了水蛭LHyal在B.subtilis中的理性调控表达;在此基础上首次提出了一菌合成低分子量（MW）HA寡糖和HAase的微生物生产模式,这也将为其他小分子多糖的微生物合成提供重要的理论基础和技术参考。同时,受本论文中一些技术方法的启发和便于后续工作的开展,相应开发了两种新的具有高通量组合编辑和组装DNA的技术,能够被广泛应用于蛋白改造、代谢工程和合成生物学等领域。主要研究结果如下:（1）基于RACE-PCR技术从水蛭RNA中克隆获得了第二类HAase家族（EC3.2.1.36）的第一个编码基因LHyal（NCBI基因登录号为KJ026763,编码489个氨基酸）。进化关系分析表明,水蛭LHyal归属在糖苷水解酶79家族。基于蛋白改造和高密度发酵策略,实现了LHyal在重组Pichia pastoris GS115中的高效分泌表达(8.42×105 U mL-1)。酶学性质表征显示LHyal酶学性能优异且底物高度专一性,不能水解硫酸软骨素、肝素和几丁质;水蛭LHyal采用非连续性内切模式（nonprocessive endolytic mode）优先降解长链的HA底物,通过控制反应水解时间,可以制备分布范围窄的低分子量HA寡聚糖,且反应终产物为HA4和HA6。（2）在B.subtilis 168中构建HA合成途径的基础上,系统性分析了两个前体UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc的内源性合成途径基因,鉴定了HA合成途径的关键基因为tuaD、gtaB、glmU、glmM和glmS。通过共表达五个关键基因和下调糖酵解途径,重组菌株HA的产量从1.01显著增加到3.16 g L-1,MW分布在1.40×106至1.83×106 Da之间。（3）通过蛋白改造策略实现了水蛭LHyal在B.subtilis 168中的活性表达;同时在翻译水平上利用核糖体结合位点（RBS）优化策略和高通量筛选技术实现了对LHyal表达水平的精细调控,获得酶活水平在2.14×103-1.58×105 U mL-1之间约70倍的表达差异;在此基础上构建了一菌直接合成不同分子量的HA寡聚糖,摇瓶发酵结果表明HA产量从3.16 g L-1显著提高到4.35 g L-1,MW由1.69×106 Da降低到2.20×103 Da;结合补料发酵策略,高分子HA重组菌株产量由3.16 g L-1显著增加到5.96 g L-1;特别是LHyal(1.62×106 U m L-1)的表达促使HA产量由5.96 g L-1显著提高到19.38 g L-1（MW为6.62×103 Da）,这一结果为目前报道微生物产HA和水蛭HAase的最高产量。（4）为了后续对HA合酶定向进化改造和对合成途径组合优化（调控元件和途径酶）工作的开展,开发了一种基于合成单链DNA文库体外高效组合编辑DNA的技术（RECODE）。建立的Two-step和One-step RECODE反应系统对DNA的编辑效率（碱基替换、插入和删除）均达到100%,为验证RECODE的应用能力,快速构建了一个启动子突变文库（活性范围8%-460%）;以专一性的水蛭LHyal进化获得了酶活性和底物特异性显著差异的突变体（一次进化实现了在489个氨基酸的蛋白中同时引入了三十多个氨基酸的突变）。同时基于RECODE方法,提出了一种同时组合改造合成途径的调控元件和酶的新技术,以该方法对合成途径的启动子、RBS和途径酶进行组合突变,目标产物实现了产量20倍的提升。（5）基于本文大量DNA重组构建和现有组装方法的启发和总结,开发了一种基于耐热DNA聚合酶和Taq DNA连接酶介导的DNA多片段组装技术（DATEL）,通过对反应系统参数优化实现了一次性无缝高效地组装2-10个DNA片段（准确率100%-74%）,组装效率和克隆正确率均明显高于Gibson等温组装技术;结果表明DATEL能够应用于快速高通量组装和优化代谢合成途径以构建多样性文库（胡萝卜素产量约20倍差异）。