目的: 近年来,肝细胞损伤尤其是肝细胞凋亡过度在肝纤维化发病机制中的作用受到了广泛关注。有研究证实肝细胞凋亡增加不仅是肝脏疾病早期损伤的重要病理改变,也是肝纤维化、肝硬化等病变形成的基本条件。因此，深入阐明肝纤维化时肝细胞凋亡的分子机制对肝纤维化及肝硬化的防治具有十分重要的意义。目前的研究认为细胞凋亡除通过死亡受体和线粒体依赖的凋亡通路介导外，内质网应激也介导了该过程，且与肝纤维化的发生有一定的联系。但是关于内质网应激介导肝细胞凋亡的具体分子机制目前仍不清楚，尤其是内质网应激介导凋亡过程中关键信号分子Caspase12的活化机制尚未完全阐明，推测可能与钙蛋白酶Calpain的活化及对Caspase12的水解有关。由于Caspase12特异定位于细胞内质网外膜，是内质网应激介导凋亡的特异性通路蛋白，因此了解和阐明 Caspase12的活化机制可能对揭示肝细胞内质网应激诱导细胞凋亡的信号通路及深入阐明肝纤维化的发生机制提供理论基础。基于上述研究背景，本实验采用CCl4诱导的大鼠肝纤维化动物模型和体外培养的经二硫苏糖醇诱导内质网应激的肝细胞为研究对象，观察钙蛋白酶 Calpain2和其抑制蛋白 Calpastatin以及内质网应激介导细胞凋亡过程中关键信号分子 Caspase12在肝细胞中的表达变化，并深入探讨它们在肝纤维化发生过程中内质网应激介导的肝细胞凋亡机制中的可能作用。　　方法: 本实验首先采用皮下注射40％ CCl4植物油溶液复制大鼠肝纤维化动物模型，通过肝组织病理学检查以及血清生化指标ALT、AST检测判断肝纤维化动物模型是否成功；应用Real-time PCR检测大鼠肝组织中GRP78、Calpain2、Calpastatin及 Caspase12 mRNA的表达水平；采用免疫组织化学法及Western Blot检测大鼠肝组织中GRP78、Calpain2、Calpastatin、Caspase12、Caspase3的表达定位及表达水平改变；同时采用TUNEL法检测大鼠肝细胞凋亡情况。其次，采用二硫苏糖醇诱导体外培养的肝细胞发生内质网应激反应，应用Real-time PCR检测 DTT诱导内质网应激后肝细胞内 GRP78、Calpain2、Calpastatin及Caspase12 mRNA的表达水平；采用细胞免疫荧光技术及Western Blot测定肝细胞内GRP78、Calpain2、Calpastatin、Caspase12及Caspase3的表达变化；同时还应用激光共聚焦和流式细胞仪检测肝细胞胞浆内游离Ca2+水平及肝细胞凋亡情况。为进一步明确内质网应激介导肝细胞凋亡的分子机制，本研究采用Calpain2 siRNA转染体外培养的肝细胞，观察在 Calpain2基因沉默的情况下，内质网应激介导细胞凋亡过程中关键信号分子Caspase12的活性变化及肝细胞凋亡的改变。　　结果: 本实验结果显示，肝纤维化4周、8周组大鼠肝脏指数、血清ALT、AST浓度均高于相应的正常对照组；肝组织病理学检查发现，肝纤维化4周组大鼠肝细胞脂肪样变明显，汇管区可见少量纤维结缔组织增生；肝纤维化8周组大鼠肝细胞脂肪样变严重，肝小叶结构破坏，汇管区纤维结缔组织大量增生，可见假小叶形成，表明本实验成功地复制了肝纤维化大鼠动物模型。采用Real-time PCR检测肝组织GRP78、Calpain2、Calpastatin及Caspase12 mRNA的结果显示，肝纤维化4周组大鼠肝组织中GRP78、Calpain2及Caspase12 mRNA的表达显著高于正常对照组大鼠，而Calpastatin mRNA的表达与正常对照组比较无显著性差异；到肝纤维化8周时，肝组织中GRP78、Calpain2、Caspase12 mRNA的表达仍保持在高水平；而Calpastatin mRNA的表达则较正常8周组大鼠显著降低。通过免疫组化和Western Blot对各指标蛋白水平的检测发现，肝纤维化4周时，大鼠肝组织中Calpain2、Calpastatin的表达与正常4周组比较无显著差异，而GRP78、Procaspase12、活性Caspase12及活性Caspase3的表达则显著增加；到肝纤维化8周时，肝组织中Calpain2的表达较正常8周组明显增多，同时GRP78、Procaspase12、活性Caspase12及活性Caspase3的表达仍保持在高水平，而Calpastatin的表达则较正常8周组显著减少。TUNEL法检测肝细胞凋亡的结果显示，肝纤维化4周及8周组大鼠肝细胞凋亡率均较正常对照组显著增加。体外培养的BRL-3A细胞经DTT处理6 h、12 h、24 h后，内质网应激标志蛋白GRP78在基因及蛋白水平的表达逐步增加，说明我们用DTT诱导肝细胞内质网应激是成功的。Real-time PCR检测结果显示体外培养的肝细胞经DTT处理6 h后，肝细胞内Calpain2及Caspase12 mRNA的表达已较正常对照组细胞显著升高；至DTT处理12 h及24 h后，肝细胞内Calpain2及Caspase12 mRNA的表达仍保持在较高水平。而肝细胞内Calpastatin mRNA的表达在DTT处理6 h及12 h后未发生显著变化；至DTT处理24 h时，肝细胞内Calpastatin mRNA的表达才较正常对照组显著增高。Western blot及细胞免疫荧光检测发现随着DTT刺激时间的延长，肝细胞内Calpain2、Procaspase12、活性Caspase12及活性Caspase3蛋白的表达均较正常对照组显著增高；而肝细胞内Calpastatin蛋白的表达在DTT处理24 h后才较正常对照组细胞显著增加。同时采用流式细胞仪检测肝细胞凋亡发现随着DTT刺激时间的延长肝细胞凋亡是逐步增多的。此外采用激光共聚焦检测发现，DTT处理体外培养的肝细胞12 h及24 h后，肝细胞胞浆内游离 Ca2+显著高于正常对照组。本研究进一步对 Calpain2及内质网的表达共定位研究发现，DTT处理12 h及24 h组肝细胞内Calpain2表达与内质网分布的重叠程度明显增高，说明在内质网应激状态下，Calpain2可能移位到了内质网上。为进一步阐明Calpain2在内质网应激介导的细胞凋亡中的作用，本研究采用小干扰RNA技术沉默体外培养的肝细胞中的Calpain2基因，然后再用DTT处理Calpain2基因沉默的肝细胞24 h，结果发现肝细胞中活性Caspase12蛋白的表达明显降低，同时用流式细胞仪检测肝细胞凋亡也显著减少。　　结论: （1）CCl4诱导大鼠肝纤维化发生过程中存在肝细胞内质网应激反应，在内质网应激状态下，Caspase12信号通路的活化可能是导致肝细胞凋亡增加的环节之一；（2）肝纤维化时，Calpain2及其抑制蛋白 Calpastatin在基因及蛋白水平的表达变化可能参与了肝纤维化过程中肝细胞凋亡的发生；（3）在内质网应激条件下，肝细胞内Ca2+浓度增高可激活Calpain2并进一步水解活化Caspase12，从而诱导肝细胞凋亡。Caspase12信号通路的活化至少是部分依赖于Calpain2的，对Calpain2基因进行沉默后，可在一定程度上抑制DTT诱导的内质网应激介导的肝细胞凋亡。