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猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)属于圆环病毒科圆环病毒属,是迄今为止发现的最小动物病毒之一,分为两型:PCV1和PCV2。PCV1无致病性,PCV2被认为是猪断奶后多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的病原,并且与其它多种猪病相关,而PMWS给世界养猪业造成了巨大的经济损失,因此PCV2成为研究的热点。近年来随着PCV2的ORF3蛋白具有细胞凋亡作用,与病毒致病性有关这一理论的提出与证实,关于ORF3蛋白功能的研究逐渐引起人们的重视。在已有理论基础之上,本研究拟构建PCV2感染性克隆,通过点突变造病毒ORF3蛋白,通过试验研究ORF3蛋白对病毒增殖的影响以及对细胞凋亡作用的影响,在病毒整体水平上研究ORF3蛋白功能,并确定主要作用区段。研究主要包括以下内容:1、PCV2-SD株全基因组克隆测序与序列分析本研究从疑似感染PMWS的病猪体内分离到一株PCV2(命名为PCV2-SD),通过PCR得到病毒全基因组进行序列分析表明,PCV2-SD的核苷酸序列与GeneBank登录的一些具有代表性的PCV2参考序列同源性高达96%～98.9%, ORF3推导氨基酸同源性92%-99%。2、PCV2-SD株感染性克隆的构建及改造将两个病毒全基因组同向串联入pUC19载体,构建双拷贝感染性克隆。在不影响ORF1正常氨基酸序列前提下,利用PCR定点诱变技术对ORF3进行改造,分别在ORF3氨基酸的第1、27、51、79位终止表达,构建四个ORF3缺失的感染性克隆。将这5个感染性克隆分别转染PK-15细胞,IFA鉴定,结果表明这五个克隆均能拯救出具有感染性的病毒粒子。3、ORF3蛋白对PCV2-SD株生物学性能的影响研究将转染质粒拯救出的五株病毒等量接种于PK-15细胞,分别在1h、12h、24h、36h、48h提取病毒DNA,定量PCR进行核酸定量,结果说明ORF3的完全或部分缺失对PCV2感染PK-15以及在PK-15内的增殖能力均无明显影响。在第48h收集PK-15细胞,进行细胞凋亡检测,结果显示ORF3缺失的PCV2仍有一定的细胞凋亡作用,证实了ORF3并非唯一的致病因素,当ORF3表达长度小于27个氨基酸时,PCV2细胞凋亡作用不明显,随着ORF3表达长度增加,其细胞凋亡作用也显著增加,本研究中,我们将ORF3蛋白主要作用区域初步定位于27-104氨基酸。