[目的](1)RNA-seq获取精神分裂症患者及健康对照者外周血mRNA及miRNA表达谱数据,评估特定差异表达基因对精神分裂症的分类效果,并探讨差异表达基因与临床维度之间的关联。(2)探索外周血差异miRNA是否可以作为精神分裂症诊治的潜在生物标志物,寻找差异miRNA表达谱与差异mRNA表达谱之间的关联。(3)基于外周血表达谱数据发现精神分裂症患者IL-1β高表达,我们构建IL-1β基因过表达细胞模型,探索其促进精神分裂症发病的潜在机制。(4)从蛋白层面,我们观察精神分裂症患者外周血表达谱数据发现的潜在生物标志物如IL-1β等在外周血清中表达是否仍存在异常,并评估血清IL-1β表达与抗精神病药物治疗应答的相关性。[方法](1)采用Illumina HiSeqTM 4000测序技术对50例精神分裂症患者和50例健康对照组的外周血白细胞进行RNA测序以获取其mRNA表达谱信息,并采用DSM-V(临床医生评定的精神分裂症症状严重程度量表)中的评分法对精神分裂症核心症状的严重度进行了评估,差异表达转录本(DETs)筛选采用R软件的edgeR包,GO/KEGG pathway分析探索差异基因生物学功能。使用Leave-one-out(LOO)交叉验证构建差异表达的免疫相关基因的随机森林分类模型,使用加权基因共表达网络分析(WGCNA)探索差异基因与8个临床维度之间的关系,采用定量实时聚合酶链反应(RT-qPCR)验证测序结果。(2)利用Illumina HiSeqTM 2500测序技术获取50名精神分裂症和50名健康对照外周血白细胞中的miRNA表达谱信息,使用Leave-one-out(LOO)交叉验证构建差异miRNAs的随机森林分类模型,并挑选了 3个平均基尼指数下降排前三的miRNAs在另一个由60名精神分裂症患者和60名健康对照者组成的独立队列中进行RT-qPCR验证,结合mRNA测序筛选的差异转录本表达水平进行Spearman相关分析与生物信息学分析,探索差异miRNAs的潜在生物学功能。(3)Homo IL-1β载体构建和慢病毒包装,慢病毒感染与嘌呤霉素药物筛选后获得稳定转染 IL-1β的SH-SY5Y细胞系,利用RT-PCR,RT-qPCR与Western-blot检测IL-1β基因及蛋白表达水平,IF检测过表达IL-1β蛋白定位情况,在SH-SY5Y中过表达IL-1β基因表达后进行CCK-8检测和RNA-seq分析,使用全基因组表达谱分析以确定IL-1β基因过表达后对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞基因表达的影响,探索IL-1β基因参与哪些生物学过程和信号通路。(4)采集56例首发或未服药的精神分裂症患者和47例健康对照者的血液样本,30项阳性和阴性症状量表(PANSS)用于评估精神分裂症患者症状严重程度。通过酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中的IL-1β,IL-17,IL-8的表达,并对接受利培酮治疗的患者自然随访6周观察其疗效,于第6周末评定PANSS评分下降率,根据PANSS评分下降率将接受利培酮治疗的精神分裂症患者分为两个亚组,包括应答者和无应答者,随访检测差异血清炎性细胞因子表达水平。[结果](1)我们共筛选出559个差异表达的转录本,包括206个下调转录本和353个上调转录本,差异基因GO分析表明差异基因主要集中于应激反应、免疫系统过程和免疫反应,KEGG通路分析表明差异基因主要参与矿物质吸收、IL-17信号传导等。14个免疫相关基因(15个差异转录本)利用留一法(LOO)构建的交叉验证随机森林分类模型ROC曲线下面积(AUC)为0.976(95%CI:0.949-1.0),随机森林分类模型提示IL1RAP(ENST00000412504),CASP1(ENST00000436863),IL-1β(ENST00000263341)是精神分裂症变量重要性排名靠前的免疫相关基因。此外,我们发现89个基因与精神运动行为异常呈正相关,且差异有统计学意义(p<0.05),我们选择其中5个差异较显著的高枢纽基因(CXCL8、EGR1、EGR3、IL-1β、PTGS2)进行定量实时聚合酶链反应(RT-qPCR)验证,精神分裂症组CXCL8、EGR1、EGR3、IL-1β、PTGS2的表达均高于健康对照组,且差异有统计学意义(P<0.05),其结果与二代测序结果一致。(2)使用非参数检验分析后发现精神分裂症患者中有15个miRNAs差异表达,其中10个表达上调,5个表达下调。单个miRNA分类效果最好的hsa-miR-124-3p的曲线下面积(AUC)为0.78,而我们发现在随机森林模型上由hsa-miR-124-3p,hsa-miR-4508,hsa-miR-490-3p 等 1 5 个 miRNAs 组成的集合分类标记物在精神分裂症和健康对照者之间实现了 0.85的曲线下面积(AUC)。随机森林分类模型提示hsa-miR-124-3p,hsa-miR-4508是精神分裂症变量重要性排名靠前的差异 miRNAs,RT-qPCR 结果显示,hsa-miR-124-3p、hsa-miR-4508、hsa-miR-490-3p同样高表达于精神分裂症患者组,且差异有统计学意义(P<0.05)。功能富集分析提示差异miRNAs的靶基因主要参与压力反应、免疫系统调控等生物学过程;Spearman相关分析提示9个差异miRNAs与7个免疫相关靶基因:ETS1(ENST00000319397),IL1RAP(ENST00000412504),CFL1(ENST00000527344),FOS(ENST00000303562),ACTG1(ENST00000575842),MAP3K8(ENST00000413724),PPP1R12A(ENST00000550299)表达呈负相关,其中,3 个差异miRNAs(hsa-miR-3130-3p,hsa-miR-490-3p,hsa-miR-9-5p)均与IL1RAP(ENST00000412504)表达呈负相关,且差异有统计学意义(P<0.05)。(3)我们从mRNA和蛋白水平进行检测发现,稳定慢病毒感染SH-SY5Y细胞相比于对照组IL-1β基因表达显著增加,免疫荧光检测发现,过表达的IL-1β位于细胞胞质内,这表明过表达IL-1β蛋白在细胞胞质中发挥功能作用。CCK-8结果显示:过表达IL-1β组中SH-SY5Y细胞的OD值在铺板后48h、72h、120h均显著高于对照组,且差异有统计学意义(P<0.05),我们对IL-1β过表达组和对照组的RNA-seq数据进行分析后发现87个显著变化的差异基因,其中上调基因有66个,下调基因有21个。过表达IL-1β基因后所产生的差异基因进行功能富集分析发现,差异基因主要富集于细胞分化调控、自主神经系统发育、神经元分化的调节等生物学过程。(4)我们发现首发或未服药精神分裂症患者IL-1β的表达较健康对照组升高,且差异有统计学意义(P<0.05),精神分裂症患者IL-8,IL-17较健康对照组略升高,但差异无统计学意义(P>0.05),通过利培酮用药自身前后配对检验发现,对利培酮应答的精神分裂症患者血清IL-1β水平较其用药前下降,但差异无统计学意义(P>0.05),对利培酮无应答的精神分裂症患者血清IL-1β水平较用药前升高,差异有统计学意义(P<0.05)。ROC曲线提示血清IL-1β在首发或未服药的精神分裂症患者和健康对照者之间实现了 0.78的曲线下面积(AUC)。利培酮治疗6周后随访血清IL-1β表达水平在应答者和无应答者也存在差异,AUC 为 0.86。[结论](1)精神分裂症患者外周血mRNA表达存在差异,我们的结果支持精神分裂症免疫假说,基于差异表达的免疫相关基因mRNA构成的的组合分类器可能有助于精神分裂症的诊断。此外,我们发现了一个与精神分裂症精神运动行为异常临床维度密切相关的基因模块(包括89个基因),提示其可作为精神分裂症个性化诊治的潜在生物标志物。(2)精神分裂症外周血白细胞中的miRNAs存在显著表达差异,差异miRNA构建的组合分类器具有作为精神分裂症潜在生物标志物的可能,差异miRNAs可能通过靶向免疫相关基因如IL1RAP,ETS1,CFL1,FOS等参与精神分裂症的发生,此外,三个差异miRNA的表达均与预测靶基因IL1RAP转录本的表达存在负相关。(3)SH-SY5Y细胞过表达1L-1β后可促进细胞增殖,IL-1β基因过表达SH-SY5Y细胞模型影响与精神分裂症风险相关基因如:CUX2、IGFBP5和EPAS1等表达,富集分析提示IL-1β可能参与神经发育,我们的研究提示免疫相关的关键基IL-1β可能在精神分裂症的发病机制中起重要作用。(4)基于外周血清IL-1β的生物标志物可能有助于精神分裂症的诊断和预测治疗结果。