研究背景动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)是当今威胁人类健康的主要疾病,随着我国老龄化的加快,心血管疾病负担日渐加重,已成为重大的公共卫生问题。西医治疗是目前ASCVD的主流疗法,然即便接受了优化药物治疗,ASCVD患者心血管事件的发生率仍较高。因此寻找新的抗ASCVD的药物势在必行。中医是中国传统文化的重要组成部分,是在古代哲学思想的指导下通过长期实践逐步形成和发展的独特医疗理论体系。近年来,中药防治心血管疾病取得了多方面进展。在基础研究领域,中医药运用活血、化痰、解毒、通络、益气等方法,在改善血管内皮功能、斑块稳定性、血小板活化、缺血再灌注、缺血预适应、左室重构、血管重构以及微循环功能等领域进行了广泛研究并取得了长足的进步。通心络是以中医络病学说为指导治疗ASCVD的经典中药复方制剂,广泛应用于慢性冠心病和脑卒中病的治疗。以往研究表明,通心络(TXL)可通过降脂、抗炎和抗氧化应激反应等多种机制发挥抗动脉粥样硬化(AS)的作用。TXL抗AS效果已被多项基础和临床研究所证实。由于TXL是由多种中草药成分组成的复方制剂,含有多种抗AS的活性成分,治疗机制仍未阐明,成为TXL研究中难以突破的关键科学问题。目前关于TXL作用机制的研究常针对西药抗AS治疗的已知靶点如降脂、抗炎和抗氧化应激,但这些机制无法完全解释TXL的抗AS作用。在本研究中,我们使用小鼠全基因组表达芯片检测了 TXL对apoE-/-小鼠基因表达的影响,探讨TXL抗AS作用的可能机制。研究目的1.明确TXL对apoE-/-小鼠AS斑块形成的影响。2.探讨TXL发挥抗AS作用的可能机制。研究方法1.TXL溶液制备体内实验,将TXL超微粉配制成不同浓度的生理盐水混悬液,小鼠每日0.1 ml混悬液灌胃给药,单纯高脂喂养(HFD)组给予相同体积的生理盐水。体外实验,用细胞培养基溶解TXL后,制备TXL储存液。2.实验分组100只雄性apoE-/-小鼠(12周龄),适应性普食喂养1周后,随机分为以下5组:对照(Control)组,单纯普食喂养16周;单纯高脂(HFD)组,单纯高脂喂养16周,小鼠每日0.1ml生理盐水灌胃;TXL低剂量(TXL-L)组,高脂喂养的基础上,给予小鼠TXL(0.38g/kg/d)0.1ml每日灌胃,喂养16周;TXL中剂量(TXL-M)组,高脂喂养的基础上,给予小鼠TXL(0.758g/kg/d)0.1ml每日灌胃,喂养16周;TXL高剂量(TXL-H)组,高脂喂养的基础上,给予小鼠TXL(1.5g/kg/d)0.1ml每日灌胃,喂养16周。3.血液标本的留取及检测检测各组小鼠血脂和血糖水平。4.组织病理学检测小鼠主动脉组织行大体油红O(Oil redO)染色,评价主动脉斑块负荷。主动脉根部连续切片后,油红O染色检测斑块内脂质含量,免疫组织化学染色检测斑块内巨噬细胞(MOMA-2)浸润和平滑肌(α-SMA)水平,天狼猩红(Sirus red)染色检测斑块内胶原含量,计算斑块易损指数。使用免疫组织化学染色的方法检测小鼠主动脉根部斑块内炎症因子TNF-α、IL-6、MMP-2的含量。5.分子生物学检测:对Control组、HFD组及TXL-H组小鼠主动脉组织行基因芯片检测,观察TXL对高脂饮食诱发AS而引起的基因表达的影响。6.细胞培养体外培养小鼠原代巨噬细胞,给予不同处理后检测相应指标。培养基配制:高糖 DMEM 培养基 450ml+FBS 50ml。7.体外实验分组及干预在原代巨噬细胞培养板中,加入不同浓度的TXL溶液预处理24小时,换液后加入氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)(40μg/ml)刺激4小时,4小时后吸弃细胞培养基,使用预冷的PBS溶液清洗3次,用于后续细胞RNA提取。8.统计分析使用SPSS 16.0(SPSS Inc,Chicago,USA)软件行统计分析。计量资料以均数±标准误表示,分类资料以百分比(%)表示。正态分布连续变量采用t检验或单因素ANOVA分析。当进行多重比较时,采用Bonferroni对p值进行校正。非正态分布连续变量采用非参数检验。p<0.05为具有统计学意义。研究结果1.TXL降低主动脉斑块负荷及主动脉根部斑块面积HE染色结果显示,TXL可逆转高脂饮食引起的斑块面积增加(与HFD组相比,p<0.05),并呈现剂量依赖性,TXL-H组较TXL-L组斑块面积降低更为显著。大体油红O染色结果显示,与Control组相比,HFD组小鼠主动脉斑块负荷显著增加(p<0.05),TXL可降低高脂饮食引起的斑块负荷的增加(与HFD组相比,p<0.05),且TXL-H组降低斑块负荷的作用尤为明显,与TXL-L组相比,具有显著差异(p<0.05)。2.TXL增加斑块稳定性TXL可显著减少高脂饮食引起的主动脉根部脂质沉积和巨噬细胞浸润,增加斑块内胶原及平滑肌细胞的含量(p<0.05),并呈剂量依赖性。TXL可显著降低斑块易损指数。3.TXL减少斑块内炎症因子的表达TXL能显著逆转高脂饮食引起的斑块内炎症因子表达的上调(p<0.05),而TXL不同剂量组之间,炎症因子的表达无显著差异。4.TXL可逆转高脂饮食诱发AS而引起的基因表达的变化。在HFD组与Control组共筛选出3284个差异表达的基因,与Control组相比,2215个基因在HFD组表达上调,1069个基因在HFD组表达下调。即高脂饮食可引起小鼠主动脉组织3284个基因的差异表达。为了明确高脂饮食后在小鼠主动脉组织中差异表达的基因,有哪些可被通心络所调控,将高脂饮食后差异表达的3284个基因,与在HFD组和TXL-H组差异表达的632个基因进行匹配分析,筛选出TXL调控的AS相关基因。匹配分析结果显示,48个基因在HFD组被上调(与Control组相比),而在TXL-H组表达水平降低(与HFD组相比);56个基因在HFD组被下调(与Control组相比),而在TXL-H组表达水平升高(与HFD组相比)。将差异表达的基因进行生物信息学分析后发现,这些基因主要分布在细胞内;按照生物学过程进行分类,这些差异表达的基因主要影响了细胞的代谢过程;按照分子功能进行分类,差异表达的基因主要影响了细胞的结合功能。通过KEGG富集分析发现,差异表达的基因主要富集在炎症和代谢相关通路。研究结论1.TXL可显著减缓小鼠主动脉斑块进展,抑制斑块内炎症因子的表达,增加斑块稳定性。2.TXL可通过多靶点发挥抗AS作用,除已证实的降脂、抑制炎症和氧化应激反应等机制外,TXL通过调节神经内分泌、调节免疫反应以及调节机体代谢发挥心血管保护作用。研究背景冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)的发病率和死亡率在我国呈逐年增加的趋势,由于经皮冠状动脉介入治疗(PCI)创伤小,手术成功率高等优点,目前已成为冠心病的重要治疗方法。自1977年Gruentzig A首次实施经皮冠状动脉成形术以来,PCI已迅速成为急性冠脉综合征(ACS)患者的一线治疗手段,极大地改善了冠心病患者的预后。PCI治疗可使大多数缺血性心脏病患者获益,对于急性心肌梗死(AMI)患者,及早行PCI开通梗死相关血管,可以尽可能地挽救濒死心肌,降低患者急性期的死亡风险并改善长期预后。但对于稳定性缺血性心脏病(SIHD)患者,是否应行PCI治疗,目前仍存在争议。ISCHEMIA实验报道,对于中度或重度冠脉狭窄的SIHD患者,在优化药物治疗的基础上进行PCI术,与单纯接受优化药物治疗相比,长期随访过程中患者心血管事件的发生率及主要终点无显著差异。这一结果提示PCI未能改善SIHD患者的长期预后,即部分SIHD患者并未从PCI治疗中获益。在可能抵消SIHD患者PCI获益的因素中,PCI术后非靶病变(NTLs)的快速进展引起了更多的关注。PCI术后NTLs快速进展的机制目前尚不明确。炎症反应可能在PCI术后NTLs快速进展的过程中起到重要作用。研究表明,对于稳定性冠心病患者,血清CRP水平在PCI术后显著升高,且术后72小时CRP的高表达与患者术后心血管事件的发生显著相关。PCI术后激活的炎症反应和氧化应激,是否在NTLs进展中发挥重要作用?明确这一问题,对于优化PCI治疗、减少急性心血管事件发生及改善患者预后,具有非常重要的临床意义。综上所述,我们提出以下假说:PCI术后炎症反应和氧化应激的激活是促进NTLs进展的重要因素。为验证假说并探讨PCI术后NTLs进展的可能机制,本研究拟采用新西兰大白兔腹主动脉动脉粥样硬化(AS)模型,分为支架植入组、假手术组和对照组,支架植入组于腹主动脉AS形成处植入支架,3个月后分别采用血管内超声和病理学方法评估支架植入术后NTLs进展情况,明确支架植入术与NTLs进展的关系。同时检测PCI或冠状动脉造影(CAG)后患者血清中炎症相关因子的动态变化,并在体外模拟PCI环境,进一步探讨支架植入引起NTLs进展的潜在机制。研究目的1.观察支架植入术后NTLs的进展情况。2.探讨炎症反应在支架植入术后NTLs进展中的作用及其机制。研究方法第一部分1.动物AS模型构建采用成年雄性新西兰大白兔,通过球囊拉伤联合高脂饮食的方法构建兔腹主动脉AS模型:新西兰兔耳缘静脉麻醉后,行右侧髂动脉至腹主动脉球囊拉伤。2%利多卡因局部麻醉,分离皮下组织,暴露右侧股动脉并穿刺,沿导丝输送3.5mm×18mm预扩球囊至腹主动脉,以8-12 atm压力充盈球囊,自腹主动脉至股动脉反复牵拉3次,以造成腹主动脉内皮损伤,撤出球囊及导丝,结扎右侧股动脉,缝合手术切口。给予40万单位青霉素肌注以预防感染。2.实验分组10周时,将实验动物随机分为以下3组:(1)支架组(n=10):行腹主动脉血管造影检查及支架植入术。分别在术中及术后三个月行腹主动脉血管内超声检查。(2)假手术组(n=10):行腹主动脉血管造影检查,不植入支架。分别在术中及术后三个月行腹主动脉血管内超声检查。(3)对照组(n=10):不进行有创操作。假手术组和支架组新西兰兔在10周时,分别进行腹主动脉造影和腹主动脉血管造影检查加支架植入术。支架组在支架植入术后给予拜阿司匹林40 mg/天,直至实验结束。3.血管内超声(IVUS)检查假手术组和支架组新西兰兔分别在介入术中及术后三个月行IVUS检查,使用Boston Scientific公司的iLab血管内超声成像系统,获得并自动记录连续性血管内超声图像。IVUS图像数据由两名独立的观察者进行分析,取两次计算数据的平均值。4.留取标本所有动物在22周时行安乐死,于左心室抽取枸橼酸钠抗凝血约15ml,置于黄色分离胶促凝管中,3000rpm室温离心10分钟,-80℃冰箱中保存备用。对于支架组和假手术组,将距离支架或血管最狭窄部位10mm以远的腹主动脉近心端,长度为50mm的血管段定义为NTLs,用于组织病理学分析,以评估斑块进展。对于对照组,我们将NTLs定义为距离髂总动脉分叉处20mm以远的腹主动脉近心端,长度为50mm的血管段,用于对照组的组织病理学研究。5.NTLs斑块评价将处理后的血管组织块进行连续切片,每张切片厚度为5μm,连续切片300μm(60张切片)后丢弃700μm,继续切片300μm后再次丢弃700μm,以此循环。收集所有切片后,每间隔100μm(10张切片)挑选一张切片进行病理学染色,用以评估NTLs的斑块形态及斑块负荷。6.NTLs斑块成分分析油红O(Oil red O)染色检测斑块内脂质含量,免疫组织化学染色检测斑块内巨噬细胞浸润(RAM-11)和平滑肌(α-SMA)水平,天狼猩红(Sirus red)染色检测斑块内胶原含量。斑块易损指数=(巨噬细胞+脂质沉积)/(胶原+平滑肌细胞)7.NTLs斑块内炎症因子检测使用免疫组织化学染色的方法检测实验动物NTLs斑块内炎症因子TNF-α、IL-6、MCP-1 和 VCAM-1 的含量。8.实验动物血清炎症因子检测使用相应的ELISA试剂盒,分别检测三组实验动物在术前、血管造影术后1天和术后3个月血清炎症因子的水平。所检测的血清炎症因子与斑块内炎症因子相对应,分别为 TNF-α、IL-6、MCP-1 和 VCAM-1。9.蛋白组学分析支架植入对血清蛋白表达的影响为探讨支架植入引起持续血管炎症和全身炎症反应的潜在机制,在血管造影术后3个月,分别采集了支架组和假手术组实验动物静脉血,对血清进行了蛋白质组学分析。10.统计分析使用SPSS 16.0(SPSS Inc,Chicago,USA)软件行统计分析。计量资料以均数±标准误表示,分类资料以百分比(%)表示。正态分布连续变量采用t检验或单因素ANOVA分析。当进行多重比较时,采用Bonferroni对p值进行校正。非正态分布连续变量采用非参数检验。p<0.05为具有统计学意义。第二部分1.研究对象本研究共纳入研究对象147例(平均年龄65±10岁),于山东大学齐鲁医院确诊为不稳定性心绞痛,并行冠状动脉造影检查。采用山东大学齐鲁医院联众病历信息查询检索系统,收集患者住院期间完整病历资料,包括:一般情况、既往病史、冠心病家族史、实验室检查及用药史。所有受试者均知情并已签署临床观察性研究知情同意书。2.血液标本的采集所有患者分别于术前、术后1天、术后1个月三个时间点,在山东大学齐鲁医院病房于无菌条件下采集外周静脉血5ml,留取血清标本,冻存于负80℃冰箱中以备检测。3.血脂及炎症相关因子水平的检测使用齐鲁医院全自动生化分析仪检测术前及术后一个月患者血脂水平。分别检测患者血清中以下细胞因子的水平,包括白介素-1β(IL-1β),IL-1RA,IL-5,IL-6,IL-8,IL-10,IL-12p70,IL-13,IL-15,肿瘤坏死因子-α(TNF-α),干扰素-γ(IFN-γ),巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α),巨噬细胞炎症蛋白-1β(MIP-1β),单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1),干扰素诱导蛋白-10(IP-10),碱性成纤维细胞生长因子(Basic-FGF)和血小板衍化生长因子(PDGF-BB),C反应蛋白(CRP),血清淀粉样蛋白A1(SAA1)。IL-1β,IL-1RA,IL-5,IL-6,IL-8,IL-10,IL-12p70,IL-13,IL-15,TNF-α,IFN-γ,MIP-1α,MIP-1β,MCP-1),IFN-γIP-10,Basic-FGF,PDGF-BB的水平使用伯乐人多因子检测试剂盒(Bio-Rad,CA,USA,Cat No:M500KCAFoY)按照试剂盒说明书中的步骤操作。CRP,SAA1的水平,使用相应的ELISA试剂盒,按照试剂盒说明书中的步骤操作。4.细胞培养体外培养HUVEC及THP-1细胞,给予不同处理后检测相应指标。HUVEC培养基配制:基础内皮细胞培养基470m1+FBS 25ml+内皮细胞生长因子5ml;THP-1细胞培养基配制:RPIM 1640培养基450ml+FBS 50ml;5.细胞分组(1)CAG组:冠脉造影术后患者血清刺激内皮细胞;(2)PCI组:PCI术后患者血清刺激内皮细胞;6.单核细胞黏附实验为了验证斑块局部的炎症反应是否由循环中炎症风暴所引起,我们使用PCI或CAG术后1天患者的血清孵育HUVECs,在孵育24小时后,检测其对单核细胞黏附能力的影响。7.蛋白质印迹法(Western Blot)收集不同干预的内皮细胞并提取总蛋白,采用Western Blot方法检测各组中TNF-α、IL-6、ICAM-1、VCAM-1等指标在蛋白水平的变化。采用Photoshop软件分析条带的平均密度值和面积。8.统计分析使用SPSS 16.0(SPSS Inc,Chicago,USA)软件行统计分析。计量资料以均数±标准误表示,分类资料以百分比(%)表示。正态分布连续变量采用t检验或单因素ANOVA分析。当进行多重比较时,采用Bonferroni对p值进行校正。非正态分布连续变量采用非参数检验。p<0.05为具有统计学意义。研究结果1.支架植入促进NTLs斑块进展假手术组实验动物腹主动脉NTLs的斑块体积自96.03 mm3增长到140.44 mm3(增长比例46.25%);斑块负荷自18.53%增长到26.47%(增长比例42.85%)。支架组实验动物腹主动脉NTLs的斑块体积自105.52 mm3增长到182.96 mm3(增长比例73.39%),斑块负荷从19.04%增长到35.14%(增长比例84.56%)。术后3个月,支架组NTLs的斑块体积显著高于假手术组(182.96±9.91mm3 vs140.44±8.98mm3,p<0.05),前者NTLs的斑块体积较后者增加30.28%。同时在术后3个月,支架组NTLs的斑块负荷显著高于假手术组(35.14±2.23%vs26.46±1.07%,p<0.05)前者NTLs的斑块负荷相对后者增加32.75%。因此,与假手术组相比,支架组NTLs斑块增加更为显著。病理学染色显示,与假手术组相比支架组的平均斑块面积和平均斑块负荷分别相对增加55.9%和27.3%。这一病理学结果提示支架植入与NTLs的快速进展有关,这与血管内超声的结果相吻合。2.支架植入增加NTLs斑块易损性术后3个月,与假手术组和对照组相比,支架组实验动物NTLs脂质沉积增多,巨噬细胞浸润增加,平滑肌含量减少,胶原含量减少,差异具有统计学意义。假手术组与对照组NTLs斑块内脂质沉积、巨噬细胞浸润、平滑肌水平及胶原含量均无显著差异,通过计算斑块易损指数,我们发现支架植入后显著增加NTLs斑块的易损性,增加斑块不稳定。3.支架植入促进实验动物NTLs斑块局部炎症反应免疫组织化学染色显示,术后3个月支架组NTLs斑块内炎症因子TNF-α、IL-6、MCP-1和VCAM-1的水平显著高于假手术组与对照组,差异具有统计学意义。假手术组与对照组NTLs内炎症因子的表达无显著差异。这些结果提示支架植入促进了 NTLs斑块内的炎症反应。4.支架植入引起实验动物持续全身炎症反应支架组实验动物血清TNF-α、IL-6、MCP-1和VCAM-1水平从术前至术后1天和术后3个月呈逐步增加趋势,在假手术组和对照组,血清中炎症因子的水平从术前到术后1天和术后3个月无显著变化;因此,在血管造影术后3个月,支架组血清TNF-α、IL-6、MCP-1和VCAM-1水平显著高于假手术组和对照组。这一结果提示支架植入术后,实验动物机体内处于持续高炎症反应状态。5.蛋白组学分析支架植入对血清蛋白水平的影响在血管造影术后3个月,我们分别采集了支架组和假手术组新西兰兔静脉血,进行蛋白质组学分析。与假手术组相比,支架组血清中多个急性时相反应蛋白(APPs)水平显著上调,包括血清淀粉样蛋白1(SAA1)SAA4,SAA,C-反应蛋白(CRP),脂多糖结合蛋白(LBP),α1-酸性糖蛋白(AAG)。这一结果提示,支架植入术后,机体处于持续的急性时相反应状态。6.差异表达蛋白生信分析我们将两组间所差异表达的蛋白进行生信分析发现,这些蛋白主要分布在胞外区域,即多为分泌蛋白,据此我们推测支架植入主要影响了细胞的分泌功能;通过KEGG富集分析发现,差异表达的蛋白多富集在免疫和炎症相关通路,包括补体-凝血级联反应,金黄色葡萄球菌感染,NF-κb,PPAR和Jak-STAT等信号通路。7.病人一般情况两组患者的一般情况、既往病史、冠心病家族史、实验室检查等基线资料无统计学差异。术前CAG组与PCI组患者血脂水平无显著差异。CAG组患者在冠脉造影术前与术后一个月,血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平无明显变化。然而,在PCI组患者血清中,TC和LDL-C的水平在PCI术后1个月相较于术前显著下降。8.PCI患者术后CRP及SAA1水平增加PCI组患者血清中CRP和SAA1水平在PCI术后1天显著升高,并持续至术后1个月。CAG组患者血清中CRP和SAA1水平在冠脉造影术后1天升高,幅度小于PCI组,且在术后1个月恢复到基线水平。9.PCI患者术后CRP高风险患者比例增加术前CAG组和PCI组CRP高水平患者所占的比例分别为18.87%和18.09%,术后1天,两组中这一比例均有所增加,分别为20.76%和41.49%,PCI组增加比例显著高于CAG组。在术后1个月,CAG组CRP高水平患者显著下降,降至基线水平以下;而PCI组CRP高水平患者的比例仍显著高于基线水平,并高于同时期CAG组。10.PCI患者术后炎症相关因子水平升高PCI组患者血清中炎症相关因子在PCI术后1天及1个月显著上升,尤其是IL-6,IL-8,IL-10,IL-13,TNF-α和IP-10,这些炎症相关因子的升高持续至术后1个月,未出现下降趋势。CAG组患者血清中17个炎症相关因子,从术前到术后1天和术后3个月无显著变化。11.PCI术后患者血清促进对内皮-单核细胞间黏附PCI术后血清孵育能显著促进内皮细胞与单核细胞之间的黏附,同时增加内皮细胞表面黏附分子ICAM-1和VCAM-1及炎症因子TNF-α、IL-6的蛋白表达。12.PCI术急性时相反应被激活我们使用PCI或CAG术后1天患者的血清孵育HUVECs,在孵育24小时后,检测急性时相反应蛋白CRP和SAA1蛋白表达及STAT3和NF-κB信号通路的激活情况。结果显示,与CAG患者血清组相比,PCI组血清孵育可以增加内皮细胞CRP和SAA1蛋白表达,同时激活STAT3和NF-κB信号通路。13.抑制STAT3或NF-κB信号通路对APPs及炎症因子表达的影响STAT3和NF-κB是启动急性时相反应的关键信号通路,使用STAT3通路抑制剂WP1066和NF-κB通路的抑制剂BAY11-7082预处理HUVECs 3小时,然后使用PCI或CAG术后1天患者的血清孵育HUVECs,在孵育24小时后,检测急性时相反应蛋白CRP和SAA1及炎症因子TNF-α、IL-6的表达,结果显示抑制STAT3或NF-κB信号通路后,可显著降低PCI组血清孵育所引起的急性时相反应蛋白CRP和SAA1以及炎症因子TNF-α和IL-6的表达。研究结论1.支架植入术可引起机体炎症反应的激活,加速兔腹主动脉NTLs斑块进展。2.支架植入术后,新西兰兔血清中CRP、SAA1等急性时相反应蛋白表达增加并持续长达数月。3.PCI术后患者体内存在持续炎症反应,多种炎症因子在PCI术后1天水平上调并持续至术后1个月。4.PCI术后NF-κB及STAT3信号通路的激活,在急性时相反应介导的NTLs快速进展过程中起到了重要作用。