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十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是植物病原菌的模式菌株之一,可以导致萝卜、白菜、甘蓝等大部分十字花科植物致病,是农作物的重要病原菌之一。GntR家族蛋白属于HTH超级家族的转录调节因子,该家族的转录因子在细菌中广泛存在,影响大多数细菌的多种生物学过程。Xcc 8004中的XC2736基因注释为GntR家族YtrA亚家族的转录调控因子。前期的研究发现XC2736(hpaR1)突变后细菌运动性降低、胞外蛋白酶活性降低,对寄主植物萝卜的致病性减弱,对非寄主植物辣椒的HR反应延迟。同时也发现HpaR1调控hrp基因簇的表达。为深入了解该转录调控因子在致病过程中的具体作用,前期工作采用双向电泳等方法,获得了一批在野生型和hpaR1突变体中差异表达的基因(未公开资料)。本工作首先借助β-葡萄糖醛酸酶基因融合表达系统和反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)鉴定受HpaR1调控的靶基因,其次对靶基因进行生物学功能分析。(1)鉴定靶基因:选取双向电泳结果中差异较大的14个基因,利用GUS基因融合表达系统确定其受HpaR1的调控关系。将候选基因预测的启动子区DNA片段(包括起始密码子)克隆到含有无起始密码子的gusA基因的pLAFR6GUS质粒上,将重组质粒分别导入野生型菌株8004和hpaR1突变体菌株。用NYGB和MMX培养基培养后,进行转录结果测定。测定结果表明:HpaR1正调控XC1358、XC0639、XC2921的表达;负调控XC3680的表达。为了进一步验证该结论,对XC1358、XC0639进行RT-PCR分析,结果一致。XC0638与XC0639是基因组中相邻且转录方向一致的两个基因,相关资料发现(未公开资料),HpaR1可能正调控XC0638的表达。本工作用RT-PCR实验证实了这一点结果。(2)靶基因的生物学功能分析:该实验构建了XC0638、XC1358、XC0639三个基因的突变体及其互补菌株。对突变体生物学功能检测结果发现:XC0638、XC1358突变后细菌的运动性减弱,致病性降低40%左右,且XC1358突变后细菌表现为聚集生长,其他表型与野生型几乎一致。XC0639突变后细菌的纤维素酶活性明显降低。推测hpaR1突变体运动性减弱,胞外纤维素酶活性降低,可能是通过HpaR1正调控运动相关基因XC0638、XC1358和纤维素酶相关基因XC0639的表达实现。总之,该实验鉴定并研究了受HpaR1正调控的三个基因,其中XC1358及XC0638影响运动性和致病性。XC0639为一个主要的纤维素酶基因。