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新生儿缺氧缺血脑损伤(HIBD)是新生儿窒息后的严重并发症,也是导致新生儿死亡及存活儿神经系统后遗症如脑瘫、癫痫、神经发育迟缓、学习障碍的重要原因。由于其发病机制复杂,目前临床上尚缺乏足够有效的治疗方法。近年来,亚低温(降低脑温2-6℃)治疗越来越受到人们的重视,它的治疗作用明显,副作用小,动物实验表明HIBD后72小时的亚低温能取得较好的疗效,且亚低温治疗已初步应用于新生儿临床,也取得了较好的效果。但是关于亚低温的治疗作用的机理尚未完全清楚,可能涉及HIBD 的多个发病环节,如降低脑氧代谢率、改善细胞能量代谢、抑制凋亡的发生、抑制细胞毒性过程、减轻脑水肿等。本实验以脑的葡萄糖代谢为主线,研究缺氧缺血及亚低温时脑葡萄糖量及ATP量的变化、与能量代谢有关的线粒体功能指标的变化及形态学的变化以及初步探讨了脑的葡萄糖载体-1的变化,以期为亚低温疗法向临床推广提供理论依据。第一部分:亚低温对新生鼠缺氧缺血脑损伤葡萄糖代谢及线粒体功能的影响方法 7日龄SD大鼠行左侧颈总动脉结扎术,然后通入8% 的氧气2小时造成缺氧缺血脑损伤模型。模型鼠随机分为常温恢复组(肛温37℃, IN 组)和亚低温恢复组(肛温32℃, IH 组)。同一窝的假手术动物作为对照组,分别为常温对照组(肛温37℃,NC组)和亚低温对照组(肛温32℃, HC 组)。将各组动物在缺氧缺血(HI)后不同时间点(0、2、6、24、48、72小时)断头取脑,测定脑匀浆葡萄糖量、ATP量;用密度离心及差速离心法提取线粒体,生化法测定脑线粒体的琥珀酸脱氢酶(SDH)和复合酶II活性,并用酶萤光法检测脑线粒体ATP合成能力。 结果 缺氧缺血常温恢复组脑组织匀浆葡萄糖在HI后即刻明显低于HI前,HI后2h即恢复正常。脑ATP量及SDH活性在HI后2-6小时先下降后再逐渐恢复, 72小时达高峰但仍明显低于正常;脑线粒体复合酶II活性及脑线粒体ATP合成能力在HI后2小时开始恢复,6小时出现第二次下降,72小时恢复正常。亚低温干预组各时间点脑组织ATP、脑线粒体SDH活性、脑线粒体复合酶II的活性及ATP的合成能力均显著高于同一时间点常温组,ATP在24 小时恢复正常,SDH在72小时恢复正常,复合酶II在48小时恢复正常,ATP合成能力在24小时恢<WP=5>复正常。结论 亚低温可减轻HIBD鼠脑组织ATP量、线粒体SDH及复合酶II活性的下降,增加脑ATP的合成,改善能量代谢,从而保护脑组织。第二部分:亚低温减轻线粒体损伤的脑保护作用的研究方法 电镜观察缺氧缺血及亚低温时0 h、72 h 脑线粒体的形态学变化,生物体视学方法计算线粒体的嵴膜密度、平均截线长、平均截面面积、平均截面周长等。同时对这些形态学参数与线粒体的功能参数(SDH、复合酶II及ATP合成能力)进行两两直线相关分析。同时我们也通过Tunel原位细胞凋亡观察肛温33℃, 持续时间72小时的亚低温对HIBD的疗效。并对72h的细胞凋亡率与6h的线粒体的各功能指标的下降百分率做相关分析。结果 脑的线粒体超微结构显示HI后0小时,线粒体的功能区发生嵴膜模糊、甚至断裂,基质凝聚,空泡变性等;72h亚低温较72h常温组比,线粒体的形态明显改善,嵴膜基本清晰,无空泡变性。提示72h的亚低温对HIBD大鼠的脑线粒体有明显的保护作用。生物体视学的计算结果表明HI后0h线粒体的比表面减小,平均截面面积增大,周长增加,表示此时线粒体肿胀,同时嵴膜密度减低,嵴的平均截线长减少,说明线粒体的嵴膜断裂。72h亚低温后,实验大鼠的脑线粒体与72h常温恢复组比较,平均截面面积减小,周长缩小,嵴膜密度增大,平均截线长增加。嵴膜密度分别与SDH、复合酶II、ATP合成能力成正相关。Tunel原位细胞凋亡检测显示肛温33℃, 持续时间72小时的亚低温可减少细胞的凋亡率,而对坏死细胞无效。且72h的细胞凋亡率与6h的线粒体的各功能指标的下降百分率呈正相关。结论 电镜的超微结构观察表明72h的亚低温可减轻缺氧缺血造成的线粒体嵴膜密度减低、线粒体肿胀等,保护线粒体膜的完整性。对HIBD大鼠的脑线粒体有明显的保护作用。体视学计算及与功能的相关关系表明亚低温可以改善线粒体功能区的结构和同时保护线粒体的功能。Tunel原位细胞凋亡检测显示肛温33℃,持续时间72小时的亚低温对HIBD有保护作用,保护作用在于减少细胞的凋亡率,而对坏死细胞无效。线粒体的功能参数与凋亡率之间的关系分析分析表明HI后的细胞凋亡率与HI后线粒体的功能指标的下降百分率之间呈显著正相关,说明能量衰竭与细胞凋亡的发生密切相关。<WP=6>第三部分 亚低温对缺氧缺血鼠脑葡萄糖转运载体-1的蛋白表达的影响方法 Western blotting的方法研究脑葡萄糖载体-1的蛋白量在缺氧缺血后0h、24h、和72h的变化及亚低温时在上述各时间点的变化。结果 在正常对照组,脑GLUT1随日龄的增加,有增加趋势,至72h脑GLUT1的表达较0h时有明显升高,说明脑的GLUT1随发育的增加是表达增高的。缺氧缺血后,脑组织GLUT 1明显升高,蛋白表达增强,在缺氧缺血结束后即刻,脑组织GLUT 1的灰度值从正常对照组的47.8升至62.4,升高了31%;在HI后24小时,脑GLUT 1 的表达达高峰,为150.6,