背景和目的:糖尿病肾病的发病机制非常复杂,迄今尚未完全阐明,近年来炎症学说备受关注,认为糖尿病是一种自然免疫和低度炎症性疾病。也有实验证明,炎症参与了糖尿病肾病的进展,炎症因子在糖尿病肾病的发生发展中可能起着重要作用,对其的深入研究,有望进一步揭示糖尿病肾病的发生机制,为临床防治糖尿病肾病提供一个新思路。糖尿病中存在的高血糖、血流动力学障碍等均可损伤肾脏固有细胞,细胞损伤后释放前炎介质如肿瘤坏死因子-α(TNF-α),导致白细胞滤出到损伤部位并活化。同时,单核巨噬细胞有高亲和力的糖基化终产物(AGE)特异性受体,在AGE刺激下可以产生大量YNF-α。淋巴细胞功能相关抗原-1(CD11a)存在于几乎所有外周血液白细胞中,其配体是细胞间黏附分子-1(ICAM-1) ,在高血糖状态下,血中自细胞的CD11a及血管壁上的ICAM-1的表达均上调,血中TNF-α的增多也可上调CD11a、ICAM-1,使内皮细胞进入活化状态,二者相互作用造成白细胞跨内皮迁移至肾脏组织局部,使局部白细胞增多,释放更多的炎症趋化因子。主要滤出的单核/巨噬细胞可通过释放TNF-α、血小板衍化生长因子(PDGF)等细胞分子及分泌细胞外基质加剧炎症,刺激系膜细胞分泌Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白导致。肾小球硬化。但TNF-α、CD11a在正常肾组织内的表达水平如何以及高血糖环境是否影响其表达,以及降糖治疗后其表达水平是否改变,目前的有关研究甚少,国内尚未见报道。因此研究TNF-α、CD1a在糖尿病肾病中表达的变化,对明确糖尿病肾病发生的机制及预防其发生发展具有重要意义。本研究应用糖尿病大鼠模型,运用免疫组化染色方法,观察了正常和糖尿病大鼠及控制血糖后糖尿病大鼠肾组织中TNF-α,CD11a抗原山东大学硕士学位论文表达水平的变化,以初步探讨二者在糖尿病肾病发生过程中的表达变化及其临床意义,探讨炎症因子在糖尿病肾病发生中的作用。 方法:雄性wister大鼠26只,2月龄,体重260一犯0g(由山东大学动物中心提供),随机分为正常对照组(n二8)、糖尿病高血糖组(n=9)和血糖控制组(n=9)。糖尿病高血糖组和血糖控制组单次腹腔注射链脉佐菌素(S Tz,55mg/kg)诱发糖尿病模型,余8只作为正常对照,注射同等剂量的柠檬酸盐缓冲液。糖尿病高血糖组大鼠每日皮下注射长效胰岛素lu,以防止酮症发生,但不明显影响血糖水平,血糖在16mmol/l以上。糖尿病血糖控制良好组据血糖每日皮下注射长效胰岛素,血糖控制在7一gmmol八。8周末用免疫组化方法分别检测TNF一。,CDlla抗原在正常对照、高血糖及血糖控制组大鼠肾脏中的表达。细胞胞浆内有棕黄色颗粒且染色强度高于背景非特异性染色者为阳性细胞。每例标本在显微镜下随机选择10个高倍镜视野(x400),计算TNF一,CDlla免疫反应阳性细胞占视野的百分比,并进行变量变换,用平方根反正弦函数变换法,变换后取每个标本的平均值进行统计分析。所有数据均以均数士标准差(又士sD)表示,采用SPSSIO.0统计软件进行分析。样本均数组间的比较用One一way ANOvA (单因素方差分析)方法,方差齐性用Student一Newman一Keuls检验,方差不齐用Tamhane’5 TZ检验。并对糖尿病组大鼠肾组织TNF一a、CDlla阳性细胞值与糖化血红蛋白(HbAlc),尿素氮(BljN),肌配(Cr)进行相关分析,只0.05表示有统计学意义。 结果: 1.定位表达 l)对照组大鼠肾小球上,于8周末检测到极其少量的TNF一Q、CD lla;肾小管上未检测到TNF一Q、CD lla的表达; 2)糖尿病组大鼠肾小球、’肾小管上,8周末均检测到TNF一。、CD lla的表达; 3)治疗组大鼠肾小球上,于8周末可检测到TNF一Q及CD lla的表达;肾小管上也检测到CD 11a的表达,未检测到TNF一a表达; 4) PBS作为一抗阴性对照组,三组肾组织均未检测到INF一Q、CDlla的表达。山东大学硕士学位论文 2.定量分析 1)1,NF一Q在正常大鼠肾组织上几乎不表达;诱发糖尿病8周,糖尿病组阳性细胞率达到3.75士1.38%,与治疗组及对照组比较表达显著增强(P<0 .05);治疗组8周末阳性细胞率为1.47士0.35%,与糖尿病组比较表达显著降低(P<0 .05),但与对照组比较表达仍然增强(尸<0.05)。 2) CDlla在正常大鼠肾组织上有少量表达,为2.05+0.83%;诱发糖尿病8周,糖尿病组阳性细胞率达到5.77士0.74%,治疗组为3.57士1.88%。糖尿病组较治疗组及对照组在肾组织的表达有显著增强(P<0 .05);治疗组与糖尿病组比较表达明显降低(尸<0.05),与对照组比较无明显差异。 3.相关性分析糖尿病组大鼠肾组织TNF一Q、CDlla阳性细胞值与GHb呈正相关(拼0.876,r=0.823,p<0.05),与BIJN呈正相关(r=0.828,r=0.776,尸<0.05),与C:呈正相关(r=0.796,r=0.808,P<0.05)。TNF一。、CDlla两者之.司呈正相关(r=0 .868,P<0.05)。 4一般资料比较治疗组GHb、BIJN、C:与糖尿病组比较显著降低(尸<0.05),治疗组BtJN、.Cr与对照组比较无明显差异(尸>0.05)。 结论: 1.高血糖环境可诱导肾组织中TNF一Q的表达,且其表达强度与GHb呈正相关,与BUN、Cr呈正相关,提示TNF一。的表达与糖尿病肾病的发生密切相关,在DN中有重要的病理意义,有可能成为监测DN发生及判断治疗效果的一项参?