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重组菌W50-EAB能够利用木糖发酵生长并积累PHB，但与以葡萄糖为碳源的发酵水平相比，木糖代谢能力还比较弱。本文首次研究了R.eutropha木糖利用的相关限速靶点。对具有木糖代谢能力的R.eutropha W50-EAB磷酸戊糖途径非氧化阶段和醛还原酶以及高亲和力转运蛋白靶点进行修饰，并对获得的重组菌株的发酵特性进行了研究。本研究主要内容包括： ⑴利用PCR技术扩增R.eutropha转酮酶基因tktA，cbb T2和转醛酶基因tal，将扩增的tktA，cbb T2和tal基因分别构建到表达载体pBBR1MCS-3上，获得重组质粒pWL1-TKT，pWL1-CBBT2和pWL1-TAL。通过电转的方式将质粒分别转化W50-EAB获得重组菌W50-KAB，W50-CAB和W50-TAB。利用基因敲除的方法，获得醛还原酶基因h16 A3186敲除株W50-EAB。通过电转的方式将重组质粒pWL1-TAL导入敲除株W50-EAB获得重组菌株W50-TAB。通过摇瓶发酵研究重组菌株W50-KAB，W50-CAB，W50-TAB，W50-EAB以及W50-TAB的发酵特性。 ⑵酶活分析结果表明，转酮酶和转醛酶基因实现表达。摇瓶发酵结果表明，转酮酶基因过表达菌株W50-KAB和W50-CAB相比于对照菌株W50-EAB/p3，表现出降低的木糖利用能力;而转醛酶基因过表达重组菌株W50-TAB以及敲除菌株W50-EAB对木糖的利用得到一定的提高。在0.1 mo1/L木糖的发酵培养基中，W50-EAB的最大比生长速率为0.035 h-1，PHB干重比为16.2±1.01％;而W50-TAB的最大比生长速率提高到0.039 h-1，PHB干重比达到20.5±0.76％;醛还原酶基因敲除菌株W50-EAB最大比生长速率提高到0.040 h-1，PHB含量提高到19.8±1.05％。结果显示转醛酶基因的过表达与醛还原酶基因的敲除对木糖利用均表现出一定的优势，将这两种优势组合获得菌株W50-TAB，摇瓶发酵分析结果为最大比生长速率达到0.042 h-1，PHB积累达到27.9±0.47％，相比于对照菌株提高了72.2％。另外，在含有葡萄糖（0.01 mol/L）和木糖（0.09 mol/L）的混合糖培养下，重组菌株W50-TAB，W50-EAB和W50-TAB相比于在纯木糖培养下都表现出更高的生物量和胞内PHB积累量。 ⑶由于重组菌株W50-TAB，W50-EAB和W50-TAB在低浓度木糖培养基培养中发酵水平和对照菌株相当，提示木糖转运蛋白是限制木糖代谢效率的一个因素。我们在携带有木糖代谢基因的W50-AB菌株内表达了来自于大肠杆菌W3110的带有自身启动子高亲和力转运蛋白基因xylFGH，但是异源基因没有在W50-AB内表达，分析原因可能是xylFGH基因的表达需要调节因子XylR的正调控。我们进一步克隆了xylFGHR基因，但是可能由于构建的重组质粒太大，没能导入W50-AB。关于高亲和力转运蛋白对木糖代谢的影响的研究还需进一步验证。 ⑷模拟了实际纤维素水解液中葡萄糖和木糖的比例，研究优势菌株W50-TAB在不同糖浓度发酵培养基中的生长，葡萄糖和木糖消耗变化以及PHB积累情况。结果表明，重组菌株能同时利用发酵液中的木糖和葡萄糖，并且葡萄糖的存在还加快了木糖的消耗速率，这说明重组菌的木糖利用没有受到葡萄糖的抑制作用，这对于混合糖发酵生产中缩短发酵周期和降低生产成本是十分有利的。