目的：应用体外培养的转移性小细胞肺癌细胞，观察骨吸收抑制剂(伊班膦酸钠)对细胞增殖和凋亡的影响，为临床应用骨吸收抑制剂治疗溶骨性骨转移瘤提供新的思路和依据。 方法：1肿瘤组织的取材临床中选择肺癌溶骨性骨转移的患者，共计6例，其中取自股骨转子间转移灶4例，椎体转移灶2例。术前未经任何治疗(主要指放、化疗等抗肿瘤治疗)，于术中无菌条件下切取转移灶实体肿瘤组织块，立即浸入无血清培养液保鲜，并迅速进行细胞培养。将获得的组织材料在无菌条件下剪切成约1～2mm3小组织块，用0.25％胰蛋白酶消化液在4℃环境下进行冷消化12～24小时，离心后去除上清液，再次加入0.25％胰蛋白酶消化液，置37℃温箱中温热消化20～30分钟，将得到的组织与细胞悬液通过100目孔径的不锈钢滤网滤过，离心后去除胰蛋白酶并用细胞培养液漂洗1～2次，然后离心去上清，制备成最终的细胞悬液。2细胞培养、筛选及纯化将最终制备的细胞悬液按5×105～1×106个/ml细胞计数接种于25ml细胞培养瓶中，加入pH值为7.0～7.2的RPMI 1640培养液4ml(内含终浓度为100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)置于37℃、5％CO2、饱和湿度的恒温培养箱进行培养，约2～4天细胞开始贴壁生长后，依据不同细胞对胰蛋白酶消化液的不同耐受时间以及差异离心的方法将原代培养的混杂生长细胞进行分离、纯化，去除成纤维细胞等杂质细胞，获得所需的肿瘤细胞。3 实验分组将处于对数生长期的骨转移瘤细胞按1×104个/ml的浓度接种到96孔细胞培养板上于培养箱内培养，待细胞贴壁生长完全覆盖孔底后，设为试验组和对照组两组，对照组加入同等质量分数的0.9％NaCl，试验组加入不同浓度(2、4、8μg/ml)的伊班膦酸钠。4细胞形态学观察倒置相差显微镜观察不同浓度和/或不同作用时间细胞形态学上的差异。5观察细胞对骨磨片的作用将预先制备厚约50～100μm、面积约4×4mm2大小的骨磨片与空白组和对照组的肿瘤细胞共同培养，于7、10天后，倒置相差显微镜观察不同浓度和/或不同作用时闻骨磨片吸收陷窝数目及形态学的差异。6 细胞增殖抑制试验采用MTT法检测伊班膦酸钠对溶骨性骨转移瘤细胞增殖抑制情况，并测定期吸光度(OD)值，从而计算细胞增殖抑制率=(1-A试验组/A对照组)×100％。7测定细胞生长曲线按1×104个/孔的浓度将单细胞悬液接种子96孔培养板中，按照实验分组分别计入0.9％NaCl。和不同浓度的伊班膦酸钠溶液，每组设3个复孔，每24小时取3孔进行消化计数，连续7天，绘制细胞生长曲线。8流式细胞术分析应用美国B.D公司的FACS-420流式细胞仪检测经不同浓度伊班膦酸钠溶液作用48小时后肿瘤细胞凋亡、细胞周期，以及细胞凋亡相关基因bcl-2与bax的表达。 结果：1 细胞形态学观察倒置相差显微镜下观察，可见空白组细胞生长良好，细胞密度较大，相互连接，呈梭形或不规则多边形。细胞透明度大、折光性强、轮廓不清。高倍镜下可部分细胞细微结构，细胞核隐约可见，胞浆内颗粒含量少。实验组细胞数明显减少，细胞折光性减弱，轮廓增强，胞浆内出现空泡，脂滴等颗粒样物质。细胞失去原有形态，贴壁性减弱，培养液中漂浮细胞数目和崩解的细胞碎片明显增多，且有明显时间及浓度梯度依赖。2 观察细胞对骨磨片的作用倒置相差显微镜下可见空白组中的骨磨片吸收陷窝较多、较深，相互连接成片，呈现梅花状、串珠状，而试验组骨磨片骨吸收陷窝形成减慢，数量减少，陷窝多呈单个圆形，难以连接成片，同样存在时间和浓度梯度依赖性。3 细胞增值抑制试验采用MTT法测定细胞增殖抑制率，显示在初始接种等量细胞数目的前提下，空白组MTT结晶物多于各试验组，测定其吸光度(OD)值高于试验组，而试验组则呈现随浓度梯度逐渐下降的趋势，其细胞增殖抑制率逐渐增高。4测定细胞生长曲线根据细胞计数结果绘制出细胞生长曲线，显示空白组细胞生长曲线接近于正常，可见典型的滞留期、指数生长期和平台期，不同浓度试验组细胞生长曲线在滞留期过后未见明显的指数生长期和平台期，较早出现下降曲线，且与药物浓度增加有相关性。5细胞凋亡率变化流式细胞仪检测显示，在相同的作用时间前提下，实验组经4μg/ml伊班膦酸钠处理的细胞，其48小时细胞凋亡率为30.14％±2.33，而空白组细胞凋亡率为3.78％±1.18，并且随着伊班膦酸钠浓度的不断增加，细胞凋亡率也随之增加；在相同药物浓度的前提下，随着作用时间的延长，细胞凋亡率也呈现递增趋势，而空白组细胞凋亡率的变化不明显。空白组与试验组相比较，差异有显著性(P＜0.05)，显示伊班膦酸钠在体外能够诱导转移性小细胞肺癌细胞凋亡。6细胞周期分析流式细胞仪细胞周期分析表明，经4μg/ml伊班膦酸钠处理的试验组细胞处于G0/G1期和S期细胞分布百分率分别为71.21％±6.68和12.1％±1.19，空白组分别为57.4％±5.32和27.5％±3.01。2μg/ml试验组细胞处于G0/G1期和S期细胞分布百分率分别为64.50％±5.21和16.61％±3.22。8μg/ml试验组细胞处于G0/G1期和S期细胞分布百分率分别为78.4％±7.28和6.71％±1.98。空白组与各试验组相比较(P＜0.05)，分布百分率差异有显著性。G2/M期细胞分布百分率则相反，不同药物浓度试验组细胞在此期内细胞分布百分率逐渐减少，空白组细胞分布百分率相对稳定。7测定Bcl-2蛋白和Bax蛋白表达量流式细胞仪间接荧光发检测Bcl-2蛋白和Bax蛋白基因表达相对含量，各浓度试验组处理小细胞肺癌细胞48小时后均使Bcl-2蛋白表达相对含量FI≤1.0(即阴性表达)，随着作用计量的增加，Bcl-2蛋白表达相对含量逐渐降低，空白组无此变化。试验组与空白组相比较(P＜0.05)，有统计学差异。试验组与空白组相比对Bax蛋白表达的相对含量调节无显著差异(P＞0.05)。 结论：在体外，试验条件下不同浓度的伊班膦酸钠均能够抑制转移性小细胞肺癌细胞增殖和诱导细胞凋亡，调控Bcl-2蛋自的表达，并呈现浓度和时间依赖性。