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细胞色素P450(CYPs)是一类含有血红素辅基,可在几乎所有生命有机体中存在的超级酶家族。这种酶参与催化内源性和外源性底物在体内的氧化反应,如类固醇、致癌物质和药物等。临床上约90％的药物是由CYP450超家族中的CYP1A2、CYP2C9、CYP2C18、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4等7种主要同工酶负责代谢的。尽管CYP2D6只占整个肝微粒体CYP含量的2%～5%,但却参与临床上大约20%～25%的药物代谢,包括抗抑郁药、抗精神病药、抗心律失常药、β-受体阻滞剂和镇痛药等。CYP酶对药物的代谢由CYP的活性部位(中心)决定的,该活性部位是由一些氨基酸残基组成,其中的一些关键氨基酸对药物-酶之间的相互作用发挥关键性的作用。现在的研究已基本确定了CYP2D6活性位点的一些关键氨基酸残基:D301、E216、F483和F120,它们是主要的底物识别结合位点,但目前对它们在药物代谢中的作用尚缺乏全面系统的研究。
目的：建立CYP2D6野生型和诱变体的COS细胞表达体系和杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统,体外表达CYP2D6野生型和F1201、E216F、D301N、F483A5种重组酶,为进一步进行CYP2D6关键氨基酸位点对药物代谢选择性和特异性影响的研究打下坚实的基础。
方法：⑴以本室保存pCMV/Myc-CYP2D6野生型和诱变体重组质粒为模板,设计包含EcoRI和XhoI的特异性引物,PCR扩增CYP2D6野生型和诱变型基因。⑵将pIRES2-EGFP载体和扩增后的基因片段同时经过EcoRI和XhoI双酶切,T4连接酶连接后转化E.coli DH5α感受态细胞,卡那霉素抗性筛选阳性克隆,扩增,提取质粒进行酶切和测序鉴定。⑶将构建的重组质粒plRES2-EGFP-CYP2D6用改良的磷酸钙介导法转染COS-7细胞,转染后14h～16h更换培养液。48h后镜下观察转染效率。⑷收集转染后72h细胞,研磨法提取含重组蛋白的S9组分,用鼠抗人CYP2D6单克隆抗体作为一抗,HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗,Western blotting检测CYP2D6的表达。⑸将本室保存的pCMV/Myc-CYP2D6重组质粒和pFastBacTM1质粒经EcoRI和XhoI双酶切,胶回收酶切片段,将回收的CYP2D6野生型及诱变体片段分别用T4连接酶与pFastBacTM1酶切片段连接,连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆培养,提取质粒,酶切和测序鉴定。⑹将pFastBac-CYP2D6重组质粒转化入E.coli DHIOBac感受态细胞,同时pFastBacTM1空质粒平行操作。经过转座,产生重组粘粒DNA(Bacmid-X)。通过蓝白筛选实验,挑选纯白色克隆培养,经过3～4次的纯化后获得单一、阳性的克隆。碱裂解法提取重组粘粒,用M13特异性引物进行PCR验证。⑺将经PCR验证正确无误的重组粘粒与Cellfectin(R)Ⅱ Reagent混合,在6孔细胞培养板中转染Sf9细胞。出现感染症状后,收集第一代病毒液。利用收获的一代病毒液继续感染Sf9细胞,3～4天后使用相同的方法收集二代病毒液。再经过3～4次的扩增得到滴度较高的病毒液。⑻在6孔细胞培养板中接种细胞,培养至融合度约为80%～90%。换液,加CYP2D6和CYPOR病毒液共感染细胞。27℃培养24h,添加新鲜配置的血红素溶液。继续培养,96h收获细胞。直接提取蛋白或冻于液氮中备用。⑼收集感染72h后的细胞,Trizol法提取总RNA,反转成cDNA。用CYP2D6特异性引物进行PCR,1%的琼脂糖凝胶电泳分析。⑽提取细胞的S9组分,用鼠抗人CYP2D6单克隆抗体作为一体,HRP标记的山羊抗小鼠IgG为第二抗体,Western blotting检测CYP2D6的表达。
结果：①以pCMV/Myc-CYP2D6为模板扩增的片段长度约为1500bp,与编码CYP2D6的序列长度一致。②卡那霉素抗性下筛选阳性克隆,提取质粒,经EcoRI和XhoI双酶切,均得到约5300kb和1500kb的片段,测序证实读码框正确无误。鉴定正确质粒命名为pIRES2-CYP2D6WT、pIRES2-CYP2D6F120I、pIRES2-CYP2D6E216F、pIRES2-CYP2D6D301N和pIRES2-CYP2D6F483A。③构建的重组质粒转染COS-7细胞,镜下观察,转染重组质粒的细胞可以看到绿色荧光,而未转染的细胞则未能观察到荧光。④转染重组质粒COS-7细胞在约55kDa左右有特异性条带,而未转染的COS-7细胞则在此位置没有条带。⑤提取质粒,构建的载体质粒经EcoRI和XhoI双酶切均得到约5000kb和1500kb的片段,测序证实读码框正确无误。所得的重组质粒命名为pFastBac-CYP2D6WT、pFastBac-CYP2D6F120I、pFastBac-CYP2D6E216F、pFastBac-CYP2D6D301N和pFastBae-CYP2D6F483A。⑥利用提取的Bacmid-CYP2D6、Bacmid-pFastBac和Bacmid-DH10Bac粘粒作为模板,使用M13(+)/M13(-)作为特异性引物进行PCR验证,未发生转座的空Bacmid、重组Bacmid-pFastBac质粒和重组Bacmid-CYP2D6的PCR扩增出的条带分别约为300bp、2300bp和3800bp。⑦采用Cellfectin(R)Ⅱ Reagent在6孔细胞培养板中转染的Sf9细胞,96h后可以观察到细胞变大变圆,边缘变亮,悬浮的细胞开始增多,即成功感染细胞,收集一代病毒。用所获的病毒液继续感染细胞,经过4～5次扩增获得了适合表达蛋白的病毒液。⑧感染5种重组病毒的Sf9细胞均能扩增出约1500bp的目的片段,而未感染的细胞则未能扩增出相应的目的片段。说明CYP2D6野生型和4种突变体在Sf9细胞中成功的实现了转录。⑨未感染重组病毒的Sf9细胞在约55kD的位置没有特异性的条带,而感染了CYP2D6重组病毒的Sf9细胞在55kD的位置有特异性的条带,说明CYP2D6野生型和突变体蛋白质在St9细胞中成功实现了表达。
结论：⑴成功构建了带有CYP2D6野生型和4种诱变体基因的真核表达载体,并能在COS-7细胞中表达。⑵获得含CYP2D6野生型和4种诱变体全长基因的重组杆状病毒,感染Sf9细胞后能表达CYP2D6重组蛋白。