视交叉上核（SCN）是哺乳动物脑内调节体内自激振荡节律的主要振荡器。有研究发现离体器官如心脏，及培养的心肌细胞在脱离神经体液的影响后，其功能活动仍能表现出整体条件下所见到的周期性节律变化，主要是近日节律变化。对于心血管系统整体水平下的不同层次，其所表现出各自所具有的节律性自主变化是否均受视交叉上核产生的生物节律信号所调制值得我们深入研究。 本课题以离体培养的心肌细胞作为研究对象，分三个部分逐步对其生物节律调节机制进行研究。首先我们将研究中枢神经系统活动节律的探针，苯二氮卓类药物安定和苯二氮卓受体内源性调节因子、时间保持激素褪黑素分别以10^-8mol/L，10^-6mol/L，10^-4mol/L三种浓度对体外培养的搏动的心肌细胞进行干预，采用针对心肌细胞运动特点而设计的图象分析软件，对心肌细胞运动进行定量分析的电子成像技术在24h六个时间点（当地时间）00：00，04：00，08：00，12：00，16：00，20：00对离体培养的收缩心肌细胞的搏动频率进行动态监测，用时间生物学单余弦法分析其生物节律变化情况。通过计算分析，我们发现离体培养的收缩心肌细胞的搏动频率均存在着显著的内源性近日节律，褪黑素及安定可以使收缩心肌细胞的搏动频率近日节律相位后移。浓度为10^-8mol/L褪黑素组的峰值相位后移比10^-6mol/L褪黑素组更明显（p＜0.05）， 四川大学博士学位论文褪黑素浓度为10一4 mol几可使收缩心肌细胞的搏动频率的近日节律消失。三种浓度的安定与对照组相比均可使近日节律相位后移，近日节律相位后移呈剂量依赖型。与浓度为10一8 m0FL褪黑素组相比，10一8 mol/L褪黑素加10一6 mol/L及10一4 mol/L安定的两组对心肌细胞搏动近日节律峰值相位后移影响不明显;其次我们再用褪黑素对离体培养的心肌细胞进行干预，用免疫细胞化学方法检测心肌细胞内mperl基因所编码的蛋白的表达。结果发现不施药的对照组心肌细胞内mPerl基因蛋白表达呈近日节律变化，其峰值相位在15:20。褪黑素组心肌细胞内mperl基因蛋白表达也呈近日节律变化，其峰值相位在17:15，与不加药的对照组相比其近日节律的峰值相位后移1.55h。褪黑素引起的心肌细胞内mperl基因蛋白表达的近日节律相位后移，情况基本与褪黑素对心肌细胞的搏动频率的影响相同;最后我们采用DNA克隆技术对抗特异基因的核酶DNA进行克隆，核酶DNA再经体外转录成小片段RNA核酶，用小片段RNA核酶瞬时转染离体培养的心肌细胞，用分子生物学技术（RT一PCR，Westem blot）检测心肌细胞内的mperl基因mRNA及其所编码的mPerl基因蛋白的表达。RT一PcR琼脂糖凝胶电泳显示，空质粒瞬时转染心肌细胞对照组的mPerl基因的PcR产物约为64obP，同预期的产物的大小相符。经软件定量分析，对照组六个时间点的mperl mRNA丰度变化呈节律性，其mRNA丰度在oo:00最低，在08:00最高:核酶瞬时转染的心肌细胞组，从RT一PCR电泳中得知mperlmRNA没有表达;W亡stem blot显示空质粒瞬时转染心肌细胞对照组在M，1 20 000的相应位置出现6条特异蛋白带，经软件定量分析，对照组六个时间点的mperl蛋白表达呈节律性变化，在04:00最低，在12:00最高。核酶瞬时转染的心肌细胞组，mperl蛋白没有表达;电子成像技术对离体培养的收缩心肌细胞的搏动频率动态监测显示空质粒瞬时转染组心肌细胞搏动频率呈现近日节律变化，其峰值相位在15:20。心肌细胞搏动频率在时间（当地时间）04:oo最慢，在12:00最快。核酶瞬时转染组心肌细胞搏动频率节律性消失。 因而我们得出结论:褪黑素及安定作为内源性授时因子可以导引离体心肌 2 四川大学博士学位论文细胞搏动的近日节律;心肌细胞内mPerl基因蛋白表达的近日节律能被褪黑素所导引;核酶可以阻断离体心肌细胞内mperl基因mRNA及mperl基因蛋白的表达;核酶可以使心肌细胞搏动的近日节律消失。由此证明mperl基因是心肌细胞内振荡器的主控基因之一，心肌细胞细胞水平自激振荡近日节律的调控是内源性因素和外源性因素共同作用的结果。说明心血管系统，从整体到器官及细胞各自所具有自主变化的内源性时间机制并非均由脑内振荡器结构所为，整体所表现的近日节律同步，是由外源因素影响及整体经多层次整合的共同结果。