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刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种危害性极大的机会性致病原虫,可感染包括人类在内的所有温血动物,虫体寄生在宿主有核细胞内的一个特化空泡(纳虫泡)中。致密颗粒蛋白(GRAs)是一种重要的虫体分泌代谢抗原,在弓形虫形成纳虫泡、获取营养物质和免疫逃避方面都有重要的作用。当弓形虫侵入宿主细胞后,致密颗粒就会向纳虫泡释放致密颗粒蛋白。GRA7蛋白是致密颗粒蛋白家族中的一个重要成员,在弓形虫的各个阶段均有表达,主要位于速殖子侵入后形成的纳虫泡和纳虫泡膜上,缓殖子的GRA7主要定位于宿主细胞的胞浆内。GRA7蛋白可以刺激机体产生体液免疫和细胞免疫。因此,GRA7基因可能是弓形虫疫苗的候选抗原基因。弓形虫在分类上虽然仅有刚地弓形虫一个种,但存在不同的基因型和毒力的虫株。在虫株基因组间存在的微小差异,可能是导致虫株毒力差异的原因。我国是养猪大国,近年来关于猪弓形虫病的流行病学数据主要来自养猪场的血清学检测报告以及屠宰生猪组织的PCR检测报告,关于临床病死猪弓形虫感染的调查报告较少,而且研究的虫株多数是弓形虫RH株和分离于猫的Chinese Ⅰ株。为此,本研究对就诊于扬州大学动物医院的病死猪进行弓形虫的PCR检测,并克隆2株猪源弓形虫ChineseⅠ型株(YZ-1、YZ-2)和2株人源弓形虫Ⅰ型株(RH、KS)的GRA7基因,对4个虫株的GRA7基因序列进行比较分析;原核表达RH和YZ-2株的GRA7蛋白,对两种重组蛋白进行免疫保护试验与交叉免疫保护试验,旨为猪弓形虫病的临床诊断、解析弓形虫的毒力分子机制和弓形虫病疫苗的研制奠定基础。1临床病死猪弓形虫的PCR检测以弓形虫529 bp基因为靶基因,采用PCR方法对采集于扬州大学动物医院就诊的59例病死猪的295份组织进行弓形虫检测。结果显示,弓形虫阳性率为86.44%(51/59),其中断奶保育猪最高(96.15%,25/26),其次是育肥猪(86.36%,19/22),哺乳期仔猪最低(63.64%,7/11),与断奶保育猪相比差异显著(P<0.05)。春季的病死猪弓形虫感染率最高(96.15%,25/26),其次为夏季(92.85%,13/14)和冬季(75.00%,6/8),秋季最低(66.64%,4/7),与春季相比差异显著(P<0.05)。组织样品中弓形虫的检出率为73.22%(216/295),其中肺脏最高(84.75%,50/59),其次为淋巴结(77.96%,46/59)、心脏(76.27%,45/59)和肝脏(66.10%,39/59),脾脏最低(61.02%,36/59),与肺脏和淋巴结相比有显著差异(P<0.05)。2不同弓形虫虫株GRA7基因的克隆与序列分析根据GenBank中弓形虫GRA7基因序列设计1对引物,以速殖子的全基因组DNA为模板,分别对分离于猪的2株弓形虫(YZ-1和YZ-2株,Chinese Ⅰ基因型),分离于人的1株弓形虫(KS株,基因型Ⅰ型),以及RH株(国际标准株)的GRA7基因全长序列进行克隆与序列分析,结合GenBank中的相关序列进行遗传进化分析。结果显示,KS株的GRA7基因完整开放阅读框长711 bp,与RH标准株完全一致;YZ-1和YZ-2株GRA7基因序列均为708 bp,与KS株相比在290～292位点缺失3个碱基;氨基酸序列和抗原表位分析显示,YZ-1和YZ-2株的GRA7蛋白在97位缺失1个谷氨酸,但比KS和RH株多1个抗原表位;Chinese Ⅰ型与Ⅱ型虫株的亲缘关系最近。3弓形虫Ⅰ型和Chinese Ⅰ型虫株GRA7基因的克隆与原核表达根据目的基因在去掉信号肽序列后以及表达载体pET-30a(+)的序列特点设计特异性引物,以构建的重组质粒RH-pGEM-T-Easy-GRA7和YZ-2-pGEM-T-Easy-GRA7为模板,经PCR扩增出大小约为633bp的目的片段,并将其插入到载体pET-30a(+)上,成功构建了重组表达载体RH-pET30a(+)-GRA7和YZ-2-pET30a(+)-GRA7;将成重组表达载体分别转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),经诱导后表达出分子量均为37 kDa的可溶性蛋白(RH-rGRA7,YZ-2-rGRA7);经 Western-blot 检测,RH-rGRA7 和 YZ-2-rGRA7 蛋白均能被抗 6×HIS 标签单抗和鼠抗重组GRA7蛋白多抗所识别,也能被用速殖子全虫可溶性蛋白免疫小鼠制备的血清所识别;用鼠抗重组GRA7蛋白多抗,Western-blot检测速殖子全虫可溶性蛋白,均发现一分子量为29 kDa的内源蛋白,即天然的GRA7蛋白。4重组RH-rGRA7和YZ-2-rGRA7蛋白的免疫保护效果以BALB/c小鼠为试验动物,三次免疫后经腹腔接种102个弓形虫速殖子,以血清抗体水平、细胞因子水平(IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-12)和小鼠存活时间为指标,评价重组蛋白RH-rGRA7和YZ-2-rGRA7的免疫保护效果及其交叉免疫保护力。结果显示,两个重组蛋白均能显著提高小鼠的血清抗体和IFN-γ水平,能显著延长小鼠的存活时间(P<0.05),且高剂量组延长时间最长;两种重组蛋白均具有良好的交叉免疫保护效果。