研究背景：炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)是一类肠道非特异性炎症疾病,主要包括未定型结肠炎(Indeterminate Colitis)、溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)及克罗恩病(Crohn’s Disease,CD)。骨髓间充质干细胞(Bone marrow Mesenchymal Stem Cell,BMSCs)是发生于骨髓中一种非造血类的干细胞,具有容易获取及无伦理学障碍、再生与多向分化潜能、低免疫原性及免疫调节等众多优点,且具有促进IBD损伤肠黏膜愈合并矫正黏膜免疫功能异常的作用,因而成为干细胞治疗IBD的首选细胞。我们前期的实验发现经静脉移植的BMSCs迁移并定植于病变肠道的数量有限,限制了其治疗作用的发挥。由于干细胞的归巢行为涉及多种趋化因子及其受体,黏附分子对等的参与。研究表明趋化因子CXC亚组受体-4/基质细胞衍生因子-1 (Chemokine Receptor-4/Stromal cell-derived Factor-1, CXCR4/SDF-1)与血管细胞粘附分子-1/人迟现抗原-4 (Vascular Cell Adhension Molecule-1/Very Late Antigen-4, VCAM-1/VLA-4)分子对在促干细胞归巢中发挥着十分重要的作用。故利用CXCR-4基因转染联合VCAM-1抗体包被BMSCs,能够使其在体内实现治疗的靶向性和高效性。实验目的：通过构建CXCR-4基因修饰BMSCs、VCAM-1抗体包被BMSCs及CXCR-4基因修饰联合VCAM-1抗体包被BMSCs,来提高BMSCs在移植治疗实验性IBD小鼠模型中的局部定植率及疗效,并探讨其促进肠黏膜愈合的机制,为临床上采取何种靶向方式治疗IBD提供理论依据。实验内容：1、探讨BMSCs移植治疗实验性IBD小鼠促损伤肠黏膜修复的免疫机制。2、构建并鉴定BMSCs、CXCR-4、VCAM-1靶向性及双重靶向性BMSCs及评估其体外迁移率。3、观察CXCR-4及VCAM-1能否促靶向性BMSCs向IBD小鼠损伤肠黏膜定向迁移并加快肠黏膜愈合。4、探讨靶向性BMSCs通过何种机制在肠道局部大量定植并发挥修复作用。实验方法：1、利用我们前期研究留取的实验性IBD小鼠及经BMSCs治疗后的血清标本,采用流式细胞技术检测Th1相关细胞因子IL-2、IFN-γ及TNF-α,Th2相关细胞因子IL-4、IL-10及Th17相关细胞因子IL-6、IL-17的水平。2、利用我们前期研究留取的实验性IBD小鼠及经BMSCs台疗后的肠道组织标本,采用Real time PCR及流式细胞技术检测Th1/Th2/Th17相关细胞因子的水平。3、采用Real time PCR及Western Blot技术检测肠道组织内Thl的主要调控因子T-bet、Th2的主要调控因子GATA-3、Th17的主要调控因子ROR-γt及Treg相关细胞因子TGF-β及主要调控因子Foxp3、Smad2的RNA及蛋白的表达情况。4、采用骨片法从雄性BALB/C小鼠(2-3周龄)的骨片中分离并体外培养BMSCs(标记为MSC组);将携带CXCR-4的慢病毒转染入BMSCs构建成CXCR4-BMSCs (C-MSC组);利用抗体包被技术将兔抗小鼠VCAM-1抗体包被于BMSCs表面构建成VCAM1-BMSCs (V-MSC组);采用基因转染联合抗体包被技术构建CXCR4-VCAM1-BMSCs(C-V-MSC组);采用Real time-PCR检测并比较CXCR-4的表达量;采用Real time-PCR及流式细胞技术检测并比较VCAM-1的表达量。5、通过四组BMSCs的形态学观察、计数法测定生长曲线、成骨成脂诱导分化鉴定、流式细胞技术检测BMSCs表面标志物、细胞周期、细胞凋亡及台盼蓝染色法测定活细胞率,来比较四组BMSCs生物学特性的变化。6、通过Transwell体外向SDF-1及含20%血清培养基迁移的实验,比较四组BMSCs勺迁移率。7、选择雌性BALB/C小鼠(6-8周龄),分别随机分为6组;并将构建好的四组BMSCs标记CM-Dil示踪：(1)对照组(标记为Control, Ctr组)：生理盐水灌肠(100μ1／只),灌肠后第2天,给予尾静脉注射不含BMSCs的PBS 0.1ml, n=21; (2) TNBS组(T组)：2.0mgTNBS/50%乙醇灌肠剂(100μ1／只),并于造模后第2天,给予尾静脉注射不含BMSCs的PBS 0.1ml, n=21; (3)TNBS-MSC移植组(MT组)：2.0mgTNBS/50%乙醇灌肠剂(100μl/只),并于造模后第2天,尾静脉注射含BMSCs(1×106/只)的PBS 0.1ml, n=21; (4) TNBS-C-MSC移植组(CMT组)：2.0mgTNBS/50%乙醇灌肠剂(100μl/只),并于造模后第2天,给予尾静脉注射含CXCR4-BMSCs(1×106/只)的PBS 0.1ml, n=21; (5) TNBS-V-MSC移植组(VMT组)：2.0mgTNBS/50%乙醇灌肠剂(100μl/只),并于造模后第2天,给予尾静脉注射含VCAM1-BMSCs(1×106/只)的PBS 0.1ml, n=21; (6) TNBS-C-V-MSC移植组(CVMT组)：2.0mgTNBS/50%乙醇灌肠剂(100μl/只),并于造模后第2天,给予尾静脉注射含CXCR4-VCAMI-BMSCs(1×106/只)的PBS 0.1ml, n=21。移植当天标记为D0,移植后第1-13天,分别记为D1-13。8、观察各组小鼠一般情况、体重变化及存活率、进行疾病活动度指数(The Disease Activity Index, DAI)评分、放大镜下管观察结肠大体形态、测量结直肠长度及进行组织病理学。9、分别于D0、D1、D3、D5、D7、D9、D11、D13天,脱颈处死小鼠3只/组,并取材血液、肠道组织、肠系膜淋巴结及脾脏,一部分进行石蜡包埋,一部分经液氮速冻后,-80℃冰箱保存。10、荧光显微镜下观察BMSCs在肠道内的定植情况,及Real time PCR检测并比较Y染色体的性别决定区段(SRY)基因的肠道局部的相对量。11、采用免疫组织化学检测细胞增殖核抗原Ki67、血管生成指标eNOS、肠道上皮间的紧密连接蛋白Claudin-1及JAM-1的表达情况。12、采用Western Blot技术检测溶菌酶(Lysozyme)、TLR-4、MyD88、TRAF-6、 ERK1/2、JNK1/2、MAPK及NF-κB的表达情况。13、采用流式细胞技术检测肠道组织VCAM-1 (CD106)的表达情况。14、采用Elisa技术检测肠道组织VLA-4的表达情况。实验结果：1、血清中Th1相关促炎性细胞因子(IL-2、IFN-γ及TNF-α)和Th17相关促炎性细胞因子(IL-6及IL-17)的水平在造模组中明显升高(p<0.05)：在BMSCs移植组中明显降低(p<0.05)。Th2相关抑炎性细胞因子(IL-4及IL-10)的水平在造模组中无明显变化(p>0.05),在BMSCs移植组中明显升高(p<0.05)。2、局部肠道组织中Th1、Th17相关促炎性细胞因子的水平在造模组中明显升高(p<0.05)；在BMSCs移植组中明显降低(p<0.05)。Th2相关抑炎性细胞因子及Treg相关抑炎性细胞因子(TGF-β)的水平在造模组中无明显变化(p>0.05),在BMSCs移植组中明显升高(p<0.05)。3、局部肠道组织中调控因子T-bet (Th1)及ROR-γt(Th17)的表达在造模组中明显升高(p<0.05);在BMSCs移植组中明显降低(p<0.05)。GATA-3 (Th2)和Foxp3 (Treg)的表达在造模组中无明显变化(p>0.05),Smad2 (Treg)的表达在造模组中降低(p<0.05)；在BMSCs移植组中明显升高(p<0.05)。4、将CXCR-4基因导入BMSCs后,可检测到C-MSC组高表达CXCR-4(p<0.05)：将VCAM-1抗体包被于BMSCs后,可检测到V-MSC组高表达VCAM-1 (p<0.05);将VCAM-1包被于CXCR-4转染的BMSCs后,可检测到C-V-MSC组同时高表达CXCR-4及VCAM-1,且CXCR-4的表达量高于C-MSC组,VCAM-1的表达量高于V-MSC组(p<0.05)。5、观察四组BMSCs均呈长梭形并束状排列;生长曲线均为S形;成脂肪转化率均在60%左右;骨结节的个数在20个左右／视野;细胞表型鉴定未发生改变(CD 105+,CD90+,CD11b-,CD45-);活细胞比率均在90%以上；以上结果无明显的差异(p>0.05);在细胞周期检测中发现过表达CXCR-4的BMSCs复制期增多(p<0.05);在细胞凋亡检测中发现V-MSC组及C-V-MSC组细胞凋亡率增加(p<0.05)。6、体外迁移实验证实：在SDF-1的诱导下,C-MSC组的迁移率>C-V-MSC组>V-MSC组>MSC组(p<0.05)；在20%FBS诱导下,C-V-MSC组的迁移率>C-MSC组>V-MSC组>MSC组(p<0.05)。7、TNBS诱导的实验性IBD模型,小鼠精神状态差、体重减轻及存活率明显下降,DAI及组织病理学评分明显上升,肉眼观察见结直肠明显缩短、缩窄,伴有充血、出血,病理见糜烂、溃疡形成、大量中性粒细胞浸润于黏膜及黏膜下层,与正常组比较均有明显差异(p<0.05);MT组、CMT组、VMT组及CVMT组移植后第2天,与T组相比,临床症状好转、体重及存活率开始上升,DAI及组织病理学评分下降,肉眼观察结直肠充血、出血及缩窄情况减轻(p<0.05);CVMT组症状缓解、体重恢复及组织病理学改变较其他治疗组快(p<0.05)。8、荧光显微镜下可见MT组、CMT组、VMT组及CVMT组的结肠组织均存在红色荧光;四组BMSCs移植组及雄性组的肠道黏膜组织中均能检测到SRY基因；体内定植率C-V-MSC组>C-MSC组>V-MSC组>MSC组。9、免疫组织化学染色结果显示：IBD模型小鼠接受BMSCs移植后,肠黏膜内Ki67、eNOS、Claudin-1及JAM-1的表达量较未接受BMSCs移植组有所升高。10、Western Blot的结果显示：TLR-4、MyD88、TRAF-6及NF-κB在T组(D0)中表达量增加,MT、CMT、VMT及CVMT组D3天肠道组织内TLR-4、MyD88、 TRAF-6及NF-κB的表达量较T组均下降,尤其以CVMT组下降最明显。Lysozyme在T组中表达量下降,治疗组均升高,以CMT组及VMT组升高明显。ERK1/2及JNK1/2在T组中相对表达量下降,MAPK的表达量升高；与T组相比,MT组、CMT组、VMT组及CVMT组,ERK1/2及JNK1/2的蛋白表达量均升高,MAPK蛋白的表达量降低,以CVMT组降低最为明显(p<0.05)。11、检测肠道内VCAM-1/VLA-4的含量结果显示：Control组为41.75%;T组下降为18.73%;BMSCs移植组不同程度地升高,CVMT组(73.51%)>VMT组(67.10%)>CMT组(66.55%)>MT组(51.42%)。Control组中含有一定量的VLA-4,D3天时,T组升高(p<0.05);MT、CMT、VMT及CVMT组较T组的含量减少,减少程度为CVMT组>VMT组>CMT组>MT组(p<0.05)：D7天时含量基本恢复正常,无差异(p>0.05)。实验结论：1、BMSCs能够通过抑制促炎性细胞因子、促进抑炎性细胞因子的分泌及恢复Th1/Th2及Th17/Treg细胞的平衡,来调控实验性IBD小鼠的全身及局部免疫状态。2、利用CXCR-4基因转染及VCAM-1抗体包被BMSCs,几乎不会改变BMSCs的生物学活性,且二者在BMSCs表面可协同表达。3、体内外实验均证实了靶向组BMSCs的迁移率增加,且CXCR-4及VCAM-1可协同强化BMSCs的迁移特性。4、在BMSCs移植治疗实验性IBD小鼠时,定植率与疗效呈正相关,并且可通过抑制过度激活的TLR/MyD88/TRAF6/NFκB信号通路,来促肠黏膜再生、修复、血管生成及上皮屏障重建。5、VCAM-1/VLA-4黏附分子对及CXCR-4/SDF-1趋化因子对通过TLR4/NFκB及ERK/JNK/MAPK信号通路发挥促迁移、定植及免疫抗炎作用。