目的:随着手术和诊断技术的不断进步,胎儿手术日益增多,孕中期一直被视为孕期手术的安全时期。手术技术的不断进步和患者数量的增加,也对妊娠期麻醉提出了更高的要求。为了满足胎儿开放手术的需要,使用吸入麻醉药已经成为宫内手术首选的方法。大量的动物实验表明常用的吸入麻醉药物对发育期未成熟的大脑会造成认知功能的损伤。尽管镇静或全身麻醉过程通常被认为是安全的,但人们逐渐意识到,相对安全的手术期对于胎儿神经系统的发育不一定是安全的,因为孕中期是神经系统发育的关键时期,此时脑内存在着广泛的神经发生。这一时期胎儿大脑容易受到外界环境因素的干扰,细微的改变都可能会导致远期神经系统的异常。作为胚胎神经发育的重要时期,孕中期麻醉药物暴露对子代脑发育的影响也逐渐受到关注,近几年逐渐有啮齿类动物研究报道孕中期麻醉药暴露干扰胎儿神经系统发育。课题组的前期工作中,将孕中期大鼠暴露于临床上最常用的吸入麻醉药七氟醚中,在2%和3.5%两种不同浓度下分别麻醉2小时,观察子代神经系统发育及学习记忆能力变化。结果发现,孕中期2小时3.5%七氟醚麻醉引起了神经干细胞凋亡的增多和增殖的抑制,并对子代大鼠产生空间学习记忆损害,而2%七氟醚麻醉的孕鼠子代没有表现出凋亡与增殖的改变及学习记忆功能损伤。随着对全身麻醉药神经毒性认识的不断深入,人们逐步发现麻醉药物神经毒性的相关机制,包括线粒体损伤、细胞内钙离子平衡紊乱等,而这些因素均可导致细胞内自噬水平的提高。自噬是细胞内的一种高度保守的自我降解过程,可以参与细胞内多种生理或病理过程,例如营养剥夺、应激状态、衰老或细胞内感染等,自噬虽然可以清除有害蛋白质和受损细胞器,但过度自噬会导致Ⅱ型细胞程序性死亡。在易受环境影响的神经发生时期,干扰细胞程序性死亡相关的过程,对神经系统的正常发育也会造成影响。除了维持细胞存活和维持细胞内稳态,自噬对正常的脑发育也是必要的。自噬参与了早期神经系统的发育,包括细胞的分化和增殖。此外干扰正常的自噬水平,会影响神经发生的过程,导致神经发育的异常。作为细胞程序性死亡的两种机制,自噬和凋亡存在着复杂的相互作用,在特定情况下,自噬促进细胞存活,防止细胞凋亡;在其他情况下,自噬会与凋亡协同,加速细胞死亡。当自噬过度活跃时会损伤细胞器,造成线粒体功能障碍,并导致细胞内蛋白质大量降解,无法维持细胞的基本功能,从而导细胞死亡。目前还没有全身麻醉药物对发育期脑的毒性作用中自噬与凋亡、增殖关系的报道,因此本研究将探讨在七氟醚对孕中期胎鼠大脑的神经毒性中自噬在凋亡、增殖中发挥的作用。作为一种肿瘤抑制基因,同源性磷酸酶张力蛋白(PTEN)与神经发育密切相关,在人、鼠脑发育过程中普遍存在,是神经发生和再生重要的内在分子。PTEN抑制胞内磷脂酰肌醇激酶(PI3K)磷酸化,从而阻断Akt及其下游激酶的活性,Akt/mTOR作为负性自噬调节通路也已经被普遍认可。在乙醇使新生鼠神经自噬增多的研究中发现,乙醇可能是通过mTOR通路来调控自噬的活性,且急性酒精暴露可使磷酸化的Akt减少。因此本实验将探讨七氟醚是否通过PTEN/Akt/mTOR信号通路调控自噬活性,且调控自噬水平后,观察子代大鼠远期学习记忆功能是否会受到影响。研究方法:1、实验动物选择Sprague Dawley(SD)大鼠,进行大鼠合笼,对怀孕14天大鼠进行麻醉药物处理,吸入2小时2%或者3.5%浓度的七氟醚。麻醉结束2小时、12小时、24小时、48小时后检测自噬相关的标记物LC3BⅡ、Beclin-1和p62的表达,用电镜观察胎鼠脑内神经干细胞中的自噬相关结构,用免疫荧光法双染LC3B和神经干细胞标记物Nestin。2、在3.5%七氟醚麻醉1小时前,对孕14天母鼠腹腔注射3-MA,其余组注射等量空白溶剂,麻醉结束上述4个时间点后用Western blot法检测抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平,用TUNEL与Nestin双染法检测凋亡神经干细胞数量。3、在3.5%七氟醚麻醉1小时前,对孕14天腹腔注射3-MA,其余组注射空白溶剂,麻醉结束上述4个时间点后用Western blot法和免疫组化法检测神经干细胞标记物Nestin表达水平,用Ki67荧光染色法检测细胞增殖。4、不同浓度七氟醚麻醉结束上述4个时间点后,用Western blot法检测各组PTEN/Akt/mTOR通路蛋白表达,使用PTEN抑制剂bpV后,Western blot法和免疫荧光双染法检测自噬相关标记物表达,TUNEl法、免疫荧光及免疫组化法检测凋亡和增殖指标。5、应用自噬抑制剂3-MA和PTEN抑制剂bpV后用Morris水迷宫测试子代雄性大鼠远期空间学习记忆功能,并在水迷宫测试结束后用NeuN免疫组化染色计数海马CA1区神经元相对数量。结果:1、孕中期2小时3.5%七氟醚麻醉激活胎鼠脑内自噬水平:自噬体形成相关蛋白LC3BⅡ和Beclin-1表达升高,自噬过程中降解蛋白p62表达降低;电镜下观察到3.5%七氟醚麻醉后胎鼠脑组织神经干细胞中出现双层膜自噬体或自噬溶酶体特异性结构;3.5%七氟醚使Nestin阳性细胞内LC3B呈斑块或点状强绿色荧光,其他组呈弥散且较弱的绿色荧光。2、应用自噬抑制剂3-MA减轻了3.5%七氟醚激活的自噬,减少了凋亡的神经干细胞:与3.5%七氟醚麻醉组相比,使用3-MA后Bcl-2表达升高,TUNEL与Nestin双阳性细胞数量减少。3、应用自噬抑制剂3-MA,缓解了神经干细胞增殖抑制:使用3-MA后减轻了3.5%七氟醚麻醉后Nestin表达的减少及Ki67阳性细胞率的降低。4、3.5%七氟醚通过PTEN/Akt/mTOR信号通路激活神经干细胞自噬:3.5%七氟醚引起PTEN表达的增高,p-Akt/Akt和mTOR的降低;应用了PTEN抑制剂bpV后,升高了p-Akt/Akt和mTOR的表达,减轻了七氟醚激活的自噬,减少TUNEL阳性细胞数量,减轻了3.5%七氟醚麻醉后Nestin表达和Ki67阳性细胞率的降低。5、应用了自噬抑制剂3-MA或者PTEN抑制剂bpV后,子代大鼠的学习记忆功能及神经发育均得到了改善:与3.5%七氟醚麻醉组子代相比,应用了自噬抑制剂3-MA或者PTEN抑制剂bpV后再进行3.5%七氟醚麻醉的大鼠子代逃避潜伏期缩短,穿越平台次数增加,并且海马CA1区神经元的数量增多。结论:孕中期2小时七氟醚麻醉对胎儿脑内神经干细胞自噬水平影响呈浓度依赖性,3.5%七氟醚升高胎儿神经干细胞自噬水平,2%七氟醚对自噬水平没有影响;抑制升高的自噬水平减轻了七氟醚麻醉引起的神经干细胞的凋亡增多、增殖抑制。3.5%七氟醚引起的胎鼠神经干细胞自噬水平激活是由PTEN/Akt/mTOR通路介导的,抑制PTEN后,激活的自噬受到抑制,减轻了七氟醚麻醉引起的神经干细胞的凋亡增多、增殖抑制。抑制自噬或PTEN均可减轻孕中期3.5%七氟醚麻醉引起的子代空间学习记忆功能损伤及神经元数量减少。