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侧根作为水稻胚后发育的重要器官,在水稻根构型建立中起着重要的作用。尽管对水稻侧根的形态和生理已经有了详尽的描述,但是对于控制水稻侧根形成的相关基因所知不多,因此对水稻侧根发生机制的研究及关键基因的克隆意义重大。本研究通过对侧根形成相关突变体的筛选,获得3个水稻侧根突变体,lrll(籼稻Kasalath)、lrl2(粳稻中花-11)、lrl3(粳稻中花-11)。图位克隆证明,三个突变体为OsCYP2基因的等位突变体,记为Oscyp2-1,Oscyp2-2,Oscyp2-3,通过对突变体表型、激素、遗传分析以及基因克隆和功能分析,我们得到以下主要研究结果：
1.OsCYP2功能缺失突变导致了侧根原基形成受阻,向重力性反应迟缓,而且伴随着发育进程,在地上部长度、主根长度、不定根数量及平均长度、侧根数量及平均长度上与野生型的差异加大,花药观察和花粉活力检测及生育期观察的结果表明OsCYP2的突变严重影响了植株的生殖发育,使得花药发育异常,颜色发白,花粉活力极差,分蘖数少,结实率差,千粒重降低等。
2.与野生型比较,等位突变体Oscyp2-1,Oscyp2-2,Oscyp2-3的NPA反应基本相似。外源施加的0.1μM NAA并不能恢复等位突变体Oscyp2-1,Oscyp2-2,Oscyp2-3侧根突变的表型,反而诱导了突变体Oscyp2-1的侧根伸长,而野生型Kasalath的侧根长度表现明显抑制。IAA含量测定表明,突变体lrll叶片和根IAA含量与野生型Kasalath比较都没有显著差异(P>0.05)。这些结果表明突变体侧根形成过程中生长素信号途径受到了严重破坏。
3.遗传分析表明,等位突变体Oscyp2-1,Oscyp2-2,Oscyp2-3为单基因隐性突变。利用图位克隆策略克隆了OsCYP2基因。OsCYP2基因定位在第2条染色体短臂上dEcoRI和PmaCI之间,为BAC克隆OSJNBb0088N06和OJ1020-C02所覆盖。三个等位突变体的突变位点不同:Oscyp2-1突变体在OsCYP2编码框215bp处发生了碱基替换,G变为C;Oscyp2-2在OsCYP2基因编码框75bp处发生了碱基替换,C变为A;Oscyp2-3在OsCYP2基因编码框44-102bp处发生了59bp的碱基缺失。
4.OsCYP2蛋白序列分析表明,在Oscyp2-1中,第72个甘氨酸(G)变为丙氨酸(A);在Oscyp2-2中,第25个半胱氨酸(C)变为终止密码子(stop),只编码了24个氨基酸；在Oscyp2-3中,第15个丙氨酸到第35个谷氨酸缺失,从而产生移码突变。同源性分析发现,OsCYP2具有4个保守的氨基酸,可能是植物在cyclophilin家族进化过程中所特有的。 5.OsCYP2基因组织表达分析表明,该基因在各组织器官中组成性表达,突变体中OsCYP2基因在根、根茎结合部、茎、叶和花中的表达与野生型差异不明显。半定量和定量RT-PCR分析证明,OsCYP2的突变影响了部分生长素响应的基因表达(比如OsPIN10a,OsIAA20等),表明OsCYP2基因可能是通过生长素响应的基因调控侧根原基的发育。