研究背景及目的:二异氰酸酯类是一类重要的致敏原,被广泛应用于刚性或软质聚氨酯泡沫工业生产中,作为一种良好的硬化剂也被应用于聚氨酯喷涂涂料和粘合剂生产中,是许多工业化国家中导致职业性哮喘最常见的原因。甲苯二异氰酸酯(TDI)是其主要类型之一,TDI所导致的职业性哮喘可产生典型的哮喘病理特征,主要包括:气道高反应性和气道炎症,气道炎症主要与淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞浸润相关。然而针对其所导致的哮喘炎症机制研究仍然十分匮乏。胸腺基质淋巴生成素(Thymic stromal lymphopoietin,TSLP)是一种类白介素(IL-)7细胞因子。TSLP主要表达于上皮细胞和皮肤角质细胞。近来研究表明,其他细胞类型如肥大细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、树突状细胞、滋养层细胞以及肿瘤或肿瘤相关细胞均可以表达TSLP。在受到各种内源性或外源性物质刺激时,TSLP表达增多,并与机体紊乱或维持稳态相关。如气道受到外界过敏原如屋尘螨或病原体刺激时会分泌大量的TSLP,进而作用于树突状细胞,上调OX40配体,促进炎症因子IL-4,IL-5,IL-13和TNF-y表达及释放,而反过来,高水平IgE和Th2相关的细胞因子(IL-4,IL-13,IL-25和IL-33)又可以促进TSLP的表达,从而形成正反馈,不断放大气道Th2炎症,促进疾病的发生发展。研究表明在卵清蛋白(OVA)哮喘小鼠模型中敲除TSLP受体后,气道炎症明显改善。而予以肺部过表达TSLP后,再予过敏原刺激,小鼠可出现明显的气道嗜酸性粒细胞炎症、粘液高分泌及气道重塑。在临床哮喘患者中,TSLP表达明显升高,并与气道炎症及气道阻塞呈正相关,而予以TSLP单克隆抗体治疗后可明显改善哮喘患者临床症状。因此,TSLP与哮喘的发病更是息息相关。然而,最新研究表明,人TSLP具有两种亚型,即长链TSLP(long TSLP,1TSLP)和短链TSLP(shortTSLP,shTSLP),他们结构相似,作用却完全不同。Long TSLP即全长TSLP(full-lengthTSLP),其分子量大小为25KDa,既往绝大多数关TSLP的研究主要指long TSLP,最早发现TSLP亚型区别的是日本的一位学者Harada M,他首次报道了当人气道上皮细胞系受到poly(I:C)刺激时会促进long TSLP表达,而不是short TSLP,因此提示了 long TSLP才是导致Th2炎症的关键因子,与short TSLP的作用可能具有差异性。而最近有关TSLP亚型的研究进一步明确了他们的差异性,在小鼠肠炎模型中,short TSLP治疗后可明显改善小鼠体重减轻并更快恢复,表明short TSLP可以保护肠炎。而且,short TSLP在体外亦可以抑制细菌的生长,发挥抗菌活性。而本课题组最新研究亦表明在屋尘螨哮喘动物模型中short TSLP亦发挥了一定的抗炎及气道屏障保护作用。那么,基于TSLP亚型的作用差异性,尤其是short TSLP的抗炎作用,大大提高了我们对TSLP的认识,目前有关short TSLP在哮喘中的作用仍少见报道,我们有必要进一步探讨short TSLP对哮喘气道炎症的影响及其可能的作用机制。本研究第一个目的,应用TDI哮喘小鼠模型,予以short TSLP多肽处理后,观察其对气道炎症的影响。气道上皮细胞作为气道与外界环境的第一道防线,不仅发挥着物理屏障的作用,更是一道免疫屏障,当气道上皮受到外界各种过敏原和病原体刺激时,会分泌大量的炎症介质,如IL-25、IL-33、TSLP、HMGB1等,进而发挥免疫调节及启动哮喘气道炎症的作用。本课题组前期研究中已经证明,高迁移率族蛋白1(HMGB1)-晚期糖基化终末产物受体(RAGE)轴在TDI哮喘气道炎症中发挥了重要作用,并可以激活PI3K/Akt信号通路,因此本研究的第二个目的,在体外合成TDI-HSA复合物并刺激人气道上皮细胞系16HBE细胞,观察其对HMGB1-RAGE轴信号及TSLP亚型表达的影响,以及short TSLP在其中的作用。方法1动物实验1.1建立TDI哮喘小鼠模型,分别通过气管内给药和腹腔注射给药方式在每次激发前30min予以short TSLP处理小鼠1.2检测小鼠气道高反应性1.3动物标本检测:取血并检测血清总IgE水平,小鼠淋巴细胞培养并检测淋巴上清中Th1相关炎症介质IFN-y及Th2相关炎症介质IL-4,IL-5,IL-13分泌水平,支气管肺泡灌洗液(BALF)细胞分类计数,小鼠肺组织病理染色,肺组织HMGB1,RAGE,TSLP及信号分子p-STAT3、p-STAT5的免疫组化及蛋白免疫印记。2细胞实验2.1体外培养正常人气道上皮细胞系16HBE细胞,分别用TDI-HSA和rhHMGB1处理细胞,并予以short TSLP进行预处理。2.2蛋白印记及实时定量PCR检测16HBE细胞HMGB1,RAGE,1TSLP及多种信号通路蛋白及1TSLP和shTSLP mRNA的表达2.3细胞免疫荧光双染技术检测HMGB1-RAGE在细胞中的表达分布情况3统计学处理采用SPSS 20.0软件进行统计分析,资料以均数±标准差表示,多组间总体均数比较采用单因素方差分析,方差齐时采用Bonferonni方法,方差不齐时用Dunnett’s T3方法,以p<0.05为有统计学意义。结果1动物实验1.1 TDI组小鼠气道反应性明显增高,而short TSLP治疗后明显改善气道高反应性,并且抑制TDI小鼠血清总IgE水平,减少TDI哮喘小鼠淋巴细胞培养上清中Th1相关炎症介质IFN-γ及Th2相关炎症介质IL-4,IL-5,IL-13释放,BALF细胞分类计数结果示:TDI组嗜酸性粒细胞和中性粒细胞明显增多,而予short TSLP治疗后明显减少。肺组织病理结果示:TDI组小鼠气道周围炎症细胞浸润明显,气道上皮增厚,呈增生改变,而short TSLP治疗组其炎症细胞浸润明显减少,气道增生不明显。1.2 TDI小鼠肺组织HMGB1、RAGE、TSLP及p-STAT5表达明显增多,而予以short TSLP治疗后明显减少。2细胞实验2.1TDI-HSA和rhHMGB1均可促进RAGE和long TSLP表达及信号分子STAT5(Y694)、Akt(S473)和 p38 MAPK(T180/Y182)的磷酸化。2.2 short TSLP 可抑制 RAGE 和 long TSLP 蛋白表达及 Akt(S473)、p38 MAPK(T180/Y182)和 STAT5(Y694)磷酸化。2.3 short TSLP抑制TDI所诱导的HMGB1核浆转位及HMGB1-RAGE共定位。结论short TSLP可明显改善TDI哮喘小鼠气道高反应性和气道炎症,其机制可能与其抑制HMGB1、RAGE和1TSLP的表达及STAT5(Y694)的磷酸化有关。