近年来,早产在我国的发生率可达百分之十左右,不仅给大多数家庭和整个社会带来巨大的经济负担和精神压力,并且对产妇和新生儿的生命健康构成了巨大的威胁。人类分娩的过程是一个特定的、复杂的、物种特异性的过程,迄今为止有关人类分娩启动的机制尚不清楚,导致临床上依然缺乏有效抑制早产的措施。近年来大量科学研究发现,在足月临产的人子宫肌以及早产的人绒毛膜、羊膜组织中促炎细胞因子:IL-1β、IL-6、TNF-α的m RNA水平明显上升,此外在足月临产的母胎-界面处免疫细胞的浸润明显增加,尤其是以中性粒细胞和单核细胞浸润增加为主[1,2],这就提示我们分娩是一种炎症反应介导的过程。所以探究炎症反应在子宫激活中发挥的作用机制,将有助于阐明人类分娩启动的分子机制,从而为临床上快速有效的抑制早产的发生提供新的治疗靶点。宫内的局部炎症反应是天然免疫所介导的一种炎症反应,其发生发展与模式识别受体的激活密切相关。NOD样受体（NOD-Like Receptors,NLRs）就是其中一种重要的模式识别受体[3,4]而NLRP3炎性小体则是NOD样受体的重要组成成分,NLRP3炎性小体是一种多蛋白复合体,主要由核心蛋白NLRP3、连接蛋白ASC以及效应蛋白Caspase-1的前体Pro-Caspase-1组成。当受到内源性信号刺激被激活后,可以诱使效应蛋白Pro-Caspase-1酶活化,经活化的Pro-Caspase-1酶进而切割形成成熟的Caspase-1,从而对促炎细胞因子IL-1β、IL-18的前体Pro-IL-1β、Pro-IL-18进行切割,释放成熟的炎性因子IL-1β、IL-18到细胞外,诱发炎症反应的发生。近年来已有研究发现,妊娠相关组织中,如子宫肌、胎膜、胎盘等组织中都存在有NLRP3炎性小体的表达[5,6],然而NLRP3炎性小体在人类分娩启动中的作用目前尚无报导,因此我们本次实验的第一部分主要围绕上述问题进行探讨。首先第一步中采用临床上收集的人妊娠组织样本（子宫肌、绒毛膜、羊膜）,探究人类足月分娩以及早产的发生是否与炎性小体的激活有关,由于伦理学的限制,在探究人类分娩的启动中,我们不能获取各个时期的妊娠相关组织样本进行相关实验研究,因此在第二步中,我们建立相关妊娠动物模型,利用整体动物水平实验的数据为我们提供重要帮助。在第一部分实验中我们分别先后在足月临产、足月未临产的人子宫肌、足月临产、足月未临产、多种早产的人绒毛膜、人羊膜中探究NLRP3炎性小体的激活是否与人类分娩启动的发生有关,以及我们建立ICR小鼠动物模型,在正常分娩、无菌性早产、感染性早产的动物模型中探究NLRP3炎性小体的激活是否与分娩启动有关。硫化氢（Hydrogen sulphide,H₂S）近年来新发现的一种新型气体信号分子[7],存在于人等哺乳动物的细胞中,经酶催化产生发挥重要的生物学效应,如抗炎、抗氧化等作用,研究发现在人体中胱硫醚-β-合酶（cystathionineβ-synthase,CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionineγ-lyase,CSE）是H₂S合成所依赖的关键酶。我们课题组之前的研究发现,H₂S合成酶:CBS和CSE在人类子宫肌组织和羊膜组织中均呈现高表达,并且与足月未临产（子宫肌、羊膜）组相比较中,足月临产（子宫肌、羊膜）组中CBS、CSE的表达明显降低,这提示我们内源性H₂S可能与人类分娩的启动有关。在人子宫肌中,在妊娠末期随着子宫收缩相关蛋白（CAPs）的表达增多,进一步刺激局部前列腺素PG产生增多,而PG作为重要的宫缩刺激物在促进子宫收缩中起到关键作用,而在胎膜组织中,前列腺素主要在羊膜和绒毛膜中合成,而最终PG的浓度则主要依靠两种极其重要的酶来决定:即环加氧酶-2（cyclooxygenase-2,COX2）[8,9]和前列腺素代谢酶-15-羟基脱氢酶（15-Hydroxyprostag1andin dehydrogenase,PGDH）[10],通过代谢酶和合成酶两种酶的共同协调作用,从而维持胎膜中一定的PG量,当代谢酶PGDH合成减少,由胎膜转运到子宫肌中的前列腺素增多,诱使子宫平滑肌开始高强度的收缩,从而触发分娩启动[11,12]。那么,临产前后人妊娠组织中H₂S的表达与收缩相关蛋白之间是否存在某些相关性呢?而已有研究发现,NF-κB和TNF-α等可以通过收缩相关蛋白COX2调节前列腺的生成增多,进而参与早产和分娩的启动。那么H₂S是否会通过介导炎症反应的应答进而调控收缩相关蛋白的表达从而参与分娩启动呢?为了阐明上述这些问题,我们进行了本课题第二大部分的研究。首先我们在临床上收集人足月临产、足月未临产的子宫肌组织、以及早产、足月临产、足月未临产的绒毛膜组织,并检测其中各组中H₂S合成酶CBS和CSE的表达,收缩相关蛋白（OTR、CX43、COX-2、PGDH）的表达以及NF-κB的磷酸化水平,统计学分析H₂S合成酶CBS和CSE与收缩相关蛋白、Pp-65之间是否存在相关性。主要实验结果如下:第一部分结果一、人足月分娩、早产的发生与NLRP3炎性小体激活之间的关系（一）足月临产人子宫肌中NLRP3炎性小体被激活1.利用Western blot方法检测,结果显示在人子宫平滑肌中有NLRP3炎性小体的表达,并且与足月未临产子宫肌组织中相比,人足月临产时,子宫肌中NLRP3的表达、ASC的表达显著升高。2.对Caspase-1酶活性进行检测分析,结果显示在足月临产时人子宫肌中Caspase-1酶活性明显增强。3.使用ELISA技术检测分析,结果显示,与足月未临产相比,在足月临产的子宫肌中炎性细胞因子IL-1β、IL-18的生成明显增多,综上显示在足月临产的子宫肌中,NLRP3炎性小体被激活。（二）足月临产、早产人绒毛膜组织中NLRP3炎性小体被激活1.利用Western blot方法检测,结果显示在人绒毛膜中有NLRP3炎性小体的表达,并且与足月未临产绒毛膜组织相比,人足月临产和早产的绒毛膜中,NLRP3的表达、ASC的表达显著升高。2.对Caspase-1酶活性进行检测分析,结果显示在足月临产和早产的绒毛膜组织中Caspase-1酶活性明显增强。3.使用ELISA技术检测分析,结果显示,与足月未临产相比,在足月临产的绒毛膜组织中炎性细胞因子IL-1β、IL-18的生成明显增多,结果显示在足月临产早产的绒毛膜中,NLRP3炎性小体被激活。（三）足月临产、早产人羊膜组织中NLRP3炎性小体被激活1.利用Western blot方法检测,结果显示在人羊膜中有NLRP3炎性小体的表达,并且与足月未临产羊膜组织中相比,人足月临产和早产的羊膜中,NLRP3的表达、ASC的表达显著升高。2.对Caspase-1酶活性进行检测分析,结果显示在足月临产和早产的羊膜组织中Caspase-1酶活性明显增强。3.使用ELISA技术检测分析,结果显示,与足月未临产相比,在足月临产和早产的羊膜组织中炎性细胞因子IL-1β、IL-18的生成明显增多,结果显示在足月临产和早产的羊膜中,NLRP3炎性小体被激活。二、在整体动物上探究NLRP3炎性小体的激活与足月临产、多种早产的发生之间的关系（一）足月临产时,小鼠子宫肌中NLRP3炎性小体被激活1.利用Western blot方法检测,结果显示在ICR小鼠子宫肌中有NLRP3炎性小体的表达,并且与未临产时收集到的子宫肌组织中相比,ICR小鼠足月临产子宫肌中,NLRP3的表达、ASC的表达都呈现显著升高趋势。2.对Caspase-1酶活性进行检测分析,结果显示在ICR小鼠足月临产的子宫肌组织中Caspase-1酶活性明显增强。3.使用ELISA技术检测分析,结果显示,与未临产时收集到的子宫肌组织相比,在ICR小鼠足月临产子宫肌组织中炎性细胞因子IL-1β、IL-18的生成都明显增多,结果显示ICR小鼠临产子宫肌中,NLRP3炎性小体都被激活。4.利用RT-PCR方法检测,结果显示在足月临产的子宫肌组织中炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α,趋化因子CCL2、CXCL15的m RNA水平呈现显著升高。5.在妊娠18.5d连续皮下注射三针炎性小体抑制剂BAY（5mg/kg）后,结果显示炎性小体抑制剂BAY可以明显推迟正常分娩。6.利用Western blot方法检测,结果显示与足月临产时收集到的子宫肌组织中相比,给予炎性小体抑制剂BAY后临产时收集的子宫肌组织中,NLRP3的表达、ASC的表达都呈现显著降低趋势。7.对Caspase-1酶活性进行检测分析,结果显示在给予炎性小体抑制剂BAY后临产时的子宫肌组织中Caspase-1酶活性明显下降。8.使用ELISA技术检测分析,结果显示,与足月临产时收集到的子宫肌组织相比,在给予炎性小体抑制剂BAY后临产子宫肌组织中炎性细胞因子IL-1β、IL-18的生成都明显下降,结果显示炎性小体抑制剂,可以抑制NLRP3炎性小体的激活。9.利用RT-PCR方法检测,结果显示在给予炎性小体抑制剂BAY后临产的子宫肌组织中炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α,趋化因子CCL2、CXCL15的m RNA水平呈现显著降低。（二）早产时小鼠子宫肌中炎性小体被激活1.无菌性早产时,小鼠子宫肌中NLRP3炎性小体被激活1.1.在妊娠15d时,孕鼠皮下注射7.5mg/kg孕酮拮抗剂RU38486,结果显示,在给予RU38486后,ICR小鼠在药物处理后24小时以内全部发生早产。1.2.孕酮拮抗剂RU38486诱导小鼠无菌性早产时,利用Western blot方法检测,结果显示在ICR小鼠子宫肌组织中有NLRP3炎性小体的表达,并且与未临产对照组收集到的子宫肌组织中相比,RU38486诱导的ICR小鼠无菌性早产子宫肌组织中,NLRP3的表达、ASC的表达都呈现显著升高趋势。1.3.对Caspase-1酶活性进行检测分析,结果显示在,RU38486诱导的ICR小鼠无菌性早产的子宫肌组织中Caspase-1酶活性都是显著增强。1.4.使用ELISA技术检测分析,结果显示,与未临产对照组时收集到的子宫肌组织相比,在RU38486诱导的ICR小鼠无菌性早产子宫肌组织中炎性细胞因子IL-1β、IL-18的生成都明显增多。1.5.孕酮拮抗剂RU38486诱导无菌性早产的小鼠子宫肌组织中,利用RT-PCR方法检测,结果显示与未临产对照组收集到的子宫肌组织中相比,无菌性早产子宫肌组织中,炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的m RNA水平呈现显著升高趋势。1.6.在妊娠15d,皮下联合给予7.5mg/kg孕酮拮抗剂RU38486（1次）,5mg/kg炎性小体抑制剂BAY（3次）,结果显示,炎性小体抑制剂BAY可以明显推迟RU38486诱导的无菌性早产。1.7.炎性小体抑制剂BAY推迟RU38486诱导的无菌性早产时,利用Western blot方法检测,结果显示在ICR小鼠子宫肌组织中有NLRP3炎性小体的表达,并且与单独给予RU38486诱导的无菌性早产组收集到的子宫肌组织相比,ICR小鼠在给予BAY后,子宫肌中NLRP3的表达、ASC的表达都呈现显著降低趋势。1.8.对Caspase-1酶活性进行检测分析,结果显示在ICR小鼠给予BAY处理的子宫肌组织中Caspase-1酶活性都是显著降低。1.9.使用ELISA技术检测分析,结果显示,与无菌性早产时收集到的子宫肌组织相比,在ICR小鼠给予BAY处理后收集到的子宫肌组织中炎性细胞因子IL-1β、IL-18的生成都明显降低。综上结果显示在孕酮拮抗剂RU38486诱导的无菌性早产中,NLRP3炎性小体被激活,给予炎性小体抑制剂BAY可以明显推迟早产的发生。1.10.利用RT-PCR方法检测上述药物处理后收集得到的子宫肌组织时,结果显示与RU38486诱导的无菌性早产组相比,给予BAY处理后炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和趋化因子CXCL15的m RNA水平呈现显著降低。2.感染性早产时,小鼠子宫肌中NLRP3炎性小体被激活2.1.在妊娠15d时,ICR孕鼠皮下给予0.5mg/kg内毒素LPS（2次）,结果显示,在给予LPS后,小鼠在20小时以内全部发生感染性早产。2.2.LPS诱导小鼠感染性早产时,利用Western blot方法检测,结果显示在ICR小鼠子宫肌组织中有NLRP3炎性小体的表达,并且与未临产对照组相比,LPS早产组子宫肌组织中,NLRP3的表达、ASC的表达都呈现显著升高趋势。2.3.对Caspase-1酶活性进行检测分析,结果显示LPS早产组子宫肌组织中Caspase-1酶活性显著增强。2.4.使用ELISA技术检测分析,结果显示,LPS早产组子宫肌组织中炎性细胞因子IL-1β、IL-18的生成明显增多。综上结果显示LPS诱导的感染性早产中,NLRP3炎性小体被激活。第二部分结果1.人足月临产的子宫肌组织中H₂S合成酶的蛋白水平表达明显下降利用Western blot方法检测,结果显示,与足月未临产相比,人足月临产子宫肌中H₂S合成酶CSE、CBS的表达明显降低。2.人足月临产的子宫肌组织中收缩相关蛋白（CAPs）的蛋白水平表达明显上升利用Western blot方法检测,结果显示,与足月未临产相比,人足月临产子宫肌中子宫收缩相关蛋白OTR、CX43、COX2的表达明显升高。3.H₂S合成酶与CAPs之间相关分析利用统计学分析软件对H₂S合成酶与CAPs之间进行相关分析,二者之间存在显著负相关。4.人足月临产的子宫肌组织中NF-κB的磷酸化水平显著升高利用Western blot方法检测,结果显示,与足月未临产相比,在足月临产的人子宫肌中NF-κB被激活5.NF-κB的磷酸化水平与CAPs之间的相关性利用统计学分析软件对NF-κB的磷酸化水平与CAPs之间进行相关分析,二者之间存在显著正相关。6.NF-κB的磷酸化水平与H₂S合成酶之间的相关性利用统计学分析软件对NF-κB的磷酸化水平与H₂S合成酶之间进行相关分析,二者之间存在显著负相关。7.人足月临产（早产）的绒毛膜组织中H₂S合成酶的蛋白水平表达明显下降利用Western blot方法检测,结果显示,与足月未临产相比,人足月临产（早产）绒毛膜组织中H₂S合成酶CSE、CBS的表达明显降低。8.人足月临产（早产）的绒毛膜组织中收缩相关蛋白PGDH蛋白水平表达明显下降利用Western blot方法检测,结果显示,与足月未临产相比,人足月临产（早产）绒毛膜组织中PGDH的表达明显降低。9.H₂S合成酶与收缩相关蛋白PGDH之间的相关分析利用统计学分析软件对H₂S合成酶与PGDH之间进行相关分析,二者之间存在显著正相关结论1、在人子宫肌、人绒毛膜、人羊膜组织中结果发现人足月临产、早产的发生都与NLRP3炎性小体的激活密切相关,在整体动物上结果进一步证实,足月临产、无菌性早产以及感染性早产的发生也与NLRP3炎性小体的激活密不可分,并且炎性小体抑制剂可以明显推迟早产以及足月临产的发生,因此提示,NLRP3炎性小体可能通过调节炎症反应的发生在分娩启动中发挥着重要的作用。2、在子宫肌和绒毛膜组织中结果发现,足月临产时H₂S合成酶CBS、CSE的表达与NF-κB的活性、收缩相关蛋白（CAPs）之间存在显著负相关,结果提示在妊娠反应过程中H₂S可能通过抑制炎症反应的发生进而抑制收缩相关蛋白的表达,从而在维持子宫静息中起到关键作用。