红霉素是我国目前年产量达万吨的抗生素产品之一，随着不断拓宽的临床用途和新一代半合成红霉素的开发，红霉素的生产和销售日趋活跃。我国已成为红霉素生产的第一大国，但发酵水平和产品质量与国外相比仍有较大差距，进一步提高其工业发酵水平是当前提高该产品的国际竞争力的迫切需求。本论文针对我国目前红霉素发酵生产过程中，发酵单位和组分问题以及设备大型化遇到的工程放大难题，以发酵过程氮调控为主要切入点，对红霉素工业规模生产菌种和基于红霉素组分改善的基因工程菌开展发酵过程优化与放大规律研究。 (一)提高红霉素发酵单位 以红霉素工业生产菌发酵为研究对象，以基础培养基氮源调控为重点，利用多参数相关分析方法在50 L发酵罐对基础培养基氮源黄豆饼粉和玉米浆进行调整，发现添加1.5％速效氮源玉米浆能提高红霉素菌丝生长前期的代谢强度OUR，红霉素发酵单位与对照相比提高了23.07％，发酵前期代谢强度OUR可作为放大的有效调控手段。代谢过程胞内、外有机酸分析表明发酵早期64 h前，胞内丙酸、柠檬酸积累高于对照组，TCA循环通量增加，红霉素合成单元丙酰辅酶A前体来源的主要氨基酸(苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸)含量在红霉素合成期(60-160 h)明显要低于对照组，表明代谢强度OUR提高能增强红霉内酯合成前体的供应，促进红霉素合成。基于代谢强度OUR为优化重点，在46 h代谢强度OUR开始下降时，流加通过两水平部分因子设计和Box-Behnken设计，响应面分析优化获得重要复合营养因子硫酸锌0.04 g/L、柠檬酸0.24 g/L、苏氨酸0.42 g/L，184 h红霉素效价达到10622 U/ml，比对照组提高了11.7％，达到了强化红霉素合成代谢流的目的。 在50 L全自动多参数发酵罐上开展红霉素发酵成本上涨主要原材料黄豆饼粉和豆油的替代研究，发现采用低碳链化合物化合物A能有效地替代豆油，并在生产规模建立了鑫氮素替代部分黄豆饼粉生产工艺。工业放大过程将尾气分析系统和主成分分析法用于红霉素生产罐发酵种子质量的控制分析，并以OUR为放大调控因子，成功实现生产规模(132 m3发酵罐和372 m3发酵罐)的发酵放大，生产规模红霉素发酵水平从原来生物效价7000 U/ml提高到8000 U/ml以上，发酵指数从0.35提高到0.4。 (二)改善红霉素发酵组分 在红霉素合成期建立氮调控策略，流加不同速效氮源玉米浆、酵母粉和硫酸铵考察对菌体生长和组分的影响。结果表明流加硫酸铵能促进后期菌丝生长，明显提高有效组分Er-A的含量，降低杂质组分Er-C的含量。对流加硫酸铵代谢调控规律进一步分析，多参数相关分析发现代谢强度OUR、CER与对照组相比明显提高，结合代谢途径关键酶分析发现，柠檬酸合成酶和谷氨酰胺合成酶明显提高，NH4+的吸收可能依靠谷氨酰胺转氨途径强化TCA循环；甲基丙二酰CoA变位酶活性和蛋白酶活性提高，以及能转化为丙酰辅酶A的主要前体氨基酸(苏氨酸、丙氨酸、蛋氨酸)流加硫酸铵后明显低于对照组，表明流加硫酸铵后TCA循环的代谢通量得到加强，蛋白分解能力提高，有更多的前体氨基酸用于红霉素合成。基于上述研究，在25 m3发酵罐开展流加硫酸铵放大试验，流加硫酸铵后，发酵203 h，Er-A达到7938 U/ml，与对照组相比提高了22.1％，Er-A与Er-C比例由对照组的4.77:1提高到14.64:1；156 m3生产罐流加硫酸铵，试验罐批发酵Er-A组分189 h达到7305 U/ml，比车间月平均对照提高了10.8％，Er-A与Er-C比例由对照组的9.48:1提高到11.69:1。 以针对红霉素组分改造的基因工程菌为研究对象，种子培养基通过氮调控发现黄豆饼粉浓度影响菌丝生长和菌丝成球特性。50 L发酵罐在发酵培养基中采用添加速效有机氮源1.5％玉米浆的调控策略，发酵过程前期生长明显加快，OUR和CER得到提高；与原工艺未添加玉米浆相比，添加玉米浆Er-A组分191 h达到8196 U/ml，提高81.8％，杂质组分Er-B未检出，组分Er-C含量为1.83％，远低于欧洲药典质量标准(Er-B≤5％，Er-C≤5％)。酶学分析表明添加玉米浆后柠檬酸合成酶和甲基丙二酰辅酶A变位酶活性明显提高，表明TCA代谢通量可能得到加强，有更多的前体供应红霉素合成。在25 m3发酵罐成功实现放大，190 h放罐时Er-A组分达到7448 U/ml，组分优势保持，基本达到50 L发酵罐发酵水平。 (三)大型发酵装置的放大规律研究 以OUR为放大调控因子，对放大过程(132 m3和372 m3发酵罐)细胞生理响应分析发现，372 m3发酵罐后期(120 h后)，胞内外有机酸分析显示TCA循环通量减弱，TCA循环中柠檬酸合成酶、谷氨酰胺合成酶、甲基丙二酰CoA变位酶的活性相比132 m3发酵罐均有所下降，以及红霉素合成关键时期(40-130 h)丙酰辅酶A的主要前体氨基酸(苏氨酸、丙氨酸、蛋氨酸)含量372 m3发酵罐高于132 m3发酵罐，反映在以OUR为放大调控因子条件下，由于反应器结构形式和操作条件的变化，细胞内仍表现不同的代谢特性，表现出372 m3发酵后期产素速率低于132 m3发酵罐；进一步采用计算流体力学(CFD)对372 m3大型发酵罐稳态流场模拟发现，整个罐内的气含率分布在底层桨以上均比较充分，而罐底则相对匮乏，有迟滞区存在，易造成罐内气体分布不均匀的问题，可能是372 m3发酵罐产生细胞生理代谢差异的原因。同时在以OUR为放大调控因子的放大过程，对影响放大结果的发酵前期高耗氧重要阶段，建立以非牛顿流体发酵液为介质的CFD模拟方法，对50 L发酵罐和132 m3发酵罐发酵前期不同时间(50 L发酵罐23 h和47 h；132 m3发酵罐16 h和47 h)流场模拟结果分析比较发现：1)在所研究范围内，对于同一反应器同样操作条件下非牛顿流体特性对流场结构影响较小；2)不同规模反应器流场之间存在很大差异，这主要是由于不同的几何规模造成的边界条件不一致造成的；3)在所研究的范围内，132 m3发酵罐的饱和氧浓度略高于50 L发酵罐。