缺血性脑卒中超早期溶栓治疗非常重要,但绝大多数患者无法从中受益。康复训练成为卒中后改善神经功能的主要手段,而缺乏有效促进神经修复的药物。中国,69%以上的脑卒中患者接受中药治疗,但中药能否促进卒中后神经修复研究甚少。地黄是治疗脑卒中的重要中药,其主要活性成分梓醇对脑缺血具有神经保护作用。但神经保护作用并不意味一定对神经功能恢复有益,且目前绝大多数神经保护剂临床试验均告无效。因此,从神经修复角度研究梓醇对脑缺血的治疗作用非常必要。目的1.观察梓醇对离体培养的SD大鼠皮质神经元生存活性及轴突生长的影响;2.观察梓醇对大鼠局灶脑缺血后神经功能恢复有无促进作用;3.了解梓醇能否透过血脑屏障;4.了解梓醇能否促进脑缺血后神经元轴突和树突生长;5.了解梓醇能否促进脑缺血后轴突有效芽生,增强突触重构;6.从神经生长促进和抑制两种因素探讨梓醇作用的分子基础。方法一、离体实验研究离体培养SD大鼠乳鼠皮质神经元,以不同浓度的梓醇干预培养至第6天的神经元,采用MTT法测定神经元生存活力和镜下观察并用测微尺测量轴突长度,了解梓醇对离体培养神经元轴突生长的影响。二、在体实验研究1.开颅法制备SD大鼠局灶性永久性脑缺血模型。造模成功后分为模型组、生理盐水组、梓醇低、中、高剂量（1、5、10mg/kg体重）治疗组和胞磷胆碱阳性药物对照组,同时设立假手术组为对照。以腹腔注射给予不同剂量梓醇为干预措施,首次给药时间分为脑缺血后6h或脑缺血后24h,每天给药一次,连续7天;2.采用Bederson评分、肌力测试、平衡木试验和前肢技巧性食物抓取试验评价各组神经功能恢复状况;3.采用高效液相色谱技术定性检测梓醇能否进入脑脊液;4.采用Golgi-Cox染色显示神经元树突和树突棘,观察梓醇对神经元树突生长的影响;5.采用免疫荧光组化和Western blot检测新生轴突和突触分子标志GAP-43和P38蛋白表达,观察梓醇对脑缺血后神经元轴突新生和突触重构的影响;6.采用电镜技术观测大脑皮质神经毡内突触数目,观察梓醇对脑缺血后神经元超微结构的影响;7.采用神经示踪和免疫荧光双标技术显示脊髓颈膨大区皮质脊髓束芽生纤维以及脑缺血灶周围残存大脑皮质与健侧感觉运动皮质区的纤维联系,观察梓醇对长距离轴突芽生的影响;8.采用免疫荧光组化和Western blot检测各实验组Nogo A、NgR、BDNF和TrkB蛋白表达变化,初步探讨梓醇促神经修复作用分子基础。结果一、离体实验结果NF-200抗原鉴定神经元,纯度达95%以上。梓醇终浓度为1、2.5和5 mg·ml^-1时,可明显促进神经元轴突延伸（P<0.05）;2.5 mg·ml^-1作用最强,显著高于空白对照组、阳性药物胞磷胆碱组和梓醇其它剂量组（P<0.05）;浓度增至5 mg·ml^-1时,其促进作用较2.5 mg·ml^-1组减弱,但无统计学意义（p>0.05）。MTT显示,梓醇对神经元生存活性无明显影响。二、在体实验结果1.梓醇促进脑缺血大鼠神经缺失功能恢复采用Bederson神经功能评分、肌力评定、平衡木行走试验和左前肢食物抓取试验等多种方法评定脑缺血后1、4、7、15和21天各实验组神经缺失功能恢复状况,证实梓醇对脑缺血后功能恢复有促进作用。在脑缺血后21天,梓醇中、高剂量组受累前肢（左）食物抓取成功率分别为48.7%±5.4%（约相当于基线值72%）和47.3%±4.8%（约相当于基线值70%）,与模型组（25.8%±4.1%,约相当于基线值38%）比较差异具有显著性（p<0.05）。提示梓醇对脑缺血后感觉运动功能恢复有促进作用。且脑缺血后21天时,术后6h开始给药组和术后24h开始给药组左前肢抓取成功率差异无显著性（p>0.05）,提示脑缺血后延迟给予梓醇治疗仍促进大鼠功能恢复。2.梓醇能够通过血脑屏障给药后40min的大鼠脑脊液,HPLC法检测分析发现在保留时间为10.4min处可见梓醇的紫外吸收峰,与脑脊液加样对照梓醇的紫外吸收峰保留时间相同,表明给药后梓醇分布到大鼠脑脊液中。3.梓醇促进大鼠脑缺血后神经元轴突和树突生长作用及可能机制（1）梓醇促进缺血灶周围大脑皮质GAP-43蛋白表达GAP-43是神经元新生轴突的分子标志。缺血灶周围区大脑皮质GAP-43阳性细胞数模型组和生理盐水组均较假手术组增加,但差异无显著性（P>0.05）;梓醇各剂量治疗组和胞磷胆碱组阳性细胞均比假手术组、模型组和生理盐水组明显增加,且梓醇各剂量治疗组比胞磷胆碱组增加更明显（p<0.05）。Western blot检测结果与此相符。提示梓醇对神经元轴突新生有促进作用。（2）梓醇促进脑缺血灶周围皮质神经元树突生长模型组缺血周围残存大脑皮质神经元树突平均分支为24.67±4.04,较假手术组14.67±2.08明显减少（p<0.05）;梓醇中剂量组为23.67±3.51,比模型组和胞磷胆碱组显著增加（p<0.05）,接近假手术组水平（p>0.05）。各组树突棘密度变化趋势与树突分支变化趋势相似。提示脑缺血后缺血灶周围大脑皮质神经元树突分支和树突棘密度均明显减少;梓醇可促进树突分叉,增加树突棘密度。（3）梓醇增强缺血灶周围大脑皮质芽生轴突与健侧感觉运动皮质区的联系绿色荧光显示BDA标记的神经细胞和纤维,绿色荧光强度系数越大反映缺血灶周围大脑皮质内BDA标记纤维的数量越多。红色荧光标记GAP-43表达阳性的神经细胞和轴突,红色荧光强度系数越大反映缺血灶周围大脑皮质具有生长反应的神经细胞和新生突纤维的数量越多。两者共定位呈黄色,显示缺血灶周围皮质新生的芽生轴突已经与健侧感觉运动皮质建立纤维联系;Pearson相关系数反映芽生轴突被BDA标记的频度,其值越大反映缺血灶周围皮质芽生轴突与健侧感觉运动皮质区的纤维联系越密切。结果绿色荧光强度系数各实验组间无明显差异（p>0.05）,提示梓醇不增加健侧感觉运动皮质区向缺血灶周围皮质区单位面积纤维投射数目。红色荧光强度系数梓醇中剂量组明显大于假手术组、模型组、生理盐水组和胞磷胆碱组（p<0.05）,提示梓醇可明显促进缺血灶周围皮质神经元轴突芽生。Pearson相关系数模型组较假手术组明显增加（p<0.05）,梓醇中剂量组明显大于模型组和胞磷胆碱组（p<0.05）,提示缺血灶周围皮质芽生轴突是缺血灶周围大脑皮质与健侧感觉运动皮质脑区建立联系的纤维基础之一;梓醇治疗可增加健侧感觉运动皮质区和缺血灶周围大脑皮质间的纤维联系。（4）梓醇增加脊髓颈膨大区健侧皮质脊髓束越边纤维数量大鼠皮质脊髓束在脊髓颈膨大节段集中走行在脊髓后（背）索。正常情况下,皮质脊髓束绝大部分纤维发枝支配同侧脊髓前角,很少越边支配对侧脊髓前角。脑缺血后,模型组健侧皮质脊髓束越边纤维占4.7%±1.3%,较假手术组1.4%±0.5%明显增加（p<0.05）,提示健侧大脑半球感觉运动皮质在脑缺血后功能恢复过程可能发挥重要作用。梓醇干预后,健侧皮质脊髓束越边纤维占8.5%±2.1%,较模型组和胞磷胆碱组（5.5%±1.8%）明显增加（p<0.05）,提示梓醇对脑缺血后神经元长距离轴突芽生有促进作用。（5）梓醇促进脊髓颈膨大区健侧皮质脊髓束纤维芽生用绿色荧光显示BDA标记的健侧皮质脊髓束,红色荧光显示GAP-43表达阳性的新生轴突纤维,BDA/GAP-43共定位后呈黄色,显示健侧皮质脊髓束芽生的轴突。BDA/GAP-43共定位分析,红色荧光强度系数越大GAP-43表达水平越高;Pearson相关系数越大脊髓颈膨大区健侧皮质脊髓束新生的芽生轴突越多。模型组红色荧光强度系数明显大于假手术组（p<0.05）;梓醇组较其他各实验组均明显增大（p<0.05）;提示梓醇对神经元轴突芽生有促进作用。模型组Pearson相关系数明显大于假手术组（p<0.05）,梓醇组较模型组和胞磷胆碱组均明显增大（p<0.05）。提示脑缺血损伤可刺激健侧皮质脊髓束芽生;梓醇对脑缺血后健侧皮质脊髓束芽生有明显促进作用。（6）梓醇下调健侧大脑皮质Nogo-A蛋白表达Nogo-A阳性细胞呈现红色,分布在损伤侧和健侧大脑皮层、海马、纹状体等脑区。大脑皮层Nogo-A阳性细胞数（个/视野）假手术组为56.33±5.51,模型组为213.33±3.78,差异具有显著性（p<0.05）;梓醇中、高剂量组分别为121.5±8.35和100.33±7.51,均比模型组、生理盐水组和胞磷胆碱组明显减少（p<0.05）。Westen blot检测结果与此相符。提示脑缺血后大脑皮质内Nogo-A表达上调,梓醇对Nogo-A蛋白表达有下调作用。（7）梓醇下调健侧大脑皮质NgR蛋白表达损伤侧和健侧大脑皮层、海马、纹状体等脑区均可见NgR阳性细胞,胞浆和突起呈绿色,细胞核未着色,具有神经元的典型形态特征。健侧大脑皮质NgR阳性细胞数假手术组、模型组和生理盐水组组间差异无显著性（p>0.05）,提示脑缺血后15天,大脑皮质内NgR表达水平接近正常生理状态。梓醇中、高剂量组NgR阳性细胞数均比模型组、生理盐水组和胞磷胆碱组明显减少（p<0.05）。Westen blot检测结果与NgR原位检测结果相符。提示梓醇对脑缺血后大脑皮质内NgR蛋白表达有下调作用。4.梓醇对大鼠脑缺血后突触重构的诱导作用及可能机制（1）梓醇上调脑缺血后脑内突触素蛋白表达突触素（P38）是突触的分子标志,用FITC标记,呈现绿色荧光。阳性着色部位呈大小较均匀的点状或颗粒状,主要分布在神经毡内。阳性着色部位IOD值模型组和生理盐水组与假手术组差异无显著性（P>0.05）,梓醇中、高剂量组均显著高于模型组和胞磷胆碱组（P<0.05）。Western blot半定量分析结果与此基本一致。提示梓醇能上调脑缺血后脑内突触素蛋白表达。（2）梓醇增加大脑感觉运动皮质神经毡内突触数目电镜下,感觉运动皮质神经毡内突触数目除假手术组外,各实验组缺血侧均比健侧减少。模型组健侧神经毡内突触数目与假手术组差异无显著性（p>0.05）,但缺血侧明显少于假手术组（p<0.05）,提示脑缺血后存在突触丢失现象;梓醇中剂量组健侧和缺血侧均比模型组和生理盐水组明显增加（p<0.05）,但与胞磷胆碱组差异无显著性（p>0.05）,提示梓醇对脑缺血后突触重构有明显促进作用。（3）梓醇促进缺血灶周围大脑皮质新生轴突形成突触连接绿色荧光显示P38标记的突触前末端,红色荧光显示GAP-43表达阳性的轴突纤维,GAP-43/P38共定位后呈现黄色,显示新生轴突形成的突触末端。用Pearson相关系数反映GAP-43/P38共定位频度。Pearson相关系数越大说明新生轴突形成突触越多。模型组和生理盐水组Pearson相关系数明显大于假手术组（p<0.05）,提示脑缺血可刺激新生轴突形成突触连接;梓醇各剂量组均比模型组明显增大（p<0.05）,且梓醇中、高剂量组明显大于胞磷胆碱组（p<0.05）。提示梓醇可增强脑缺血后新生轴突形成新的突触连接,促进脑缺血后有效轴突芽生。（4）梓醇上调缺血灶周围大脑皮质BDNF蛋白表达BDNF阳性细胞被Cy3标记,胞浆和突起呈现红色,胞核不着色,阳性细胞主要为神经元。BDNF阳性细胞数模型组和生理盐水组均较假手术组明显增加（P<0.05）,提示脑缺血后BDNF表达上调;梓醇治疗组均比模型组明显增加（P<0.05）,且梓醇中、高剂量治疗组也比胞磷胆碱组明显增加（P<0.05）。Western blot检测结果与此相符。提示梓醇可上调脑缺血后BDNF蛋白表达。（5）梓醇上调缺血灶周围大脑皮质TrkB蛋白表达TrkB阳性细胞胞浆和突起被FITC标记,呈现绿色,胞核不着色。缺血灶周围大脑皮质TrkB阳性细胞数模型组较假手术组有减少趋势,但差异无显著性（P>0.05）;梓醇中剂量治疗组明显多于模型组和胞磷胆碱组（P<0.05）。Western blot检测结果与此相符。提示梓醇可上调脑缺血后TrkB蛋白表达。结论梓醇可下调脑缺血后脑组织内Nogo-A和NgR蛋白表达,促进神经元轴突和树突生长;可上调脑缺血后BDNF和TrkB蛋白表达,增强突触重构;明显促进脑缺血后受累肢体神经功能恢复;是一种极具潜力的促进脑缺血后神经修复的候选药物。