牙齿是由矿物组织及其包围的牙髓组织组成的复杂器官。保持牙髓的活力对维持牙齿的营养和正常的新陈代谢有着重要作用。如果牙髓失去功能就不能形成由于外界刺激产生的修复性牙本质,牙髓牙本质复合体失去对敏感刺激的传导以及感知痛觉能力,丧失免疫反应。牙髓组织的主要组成是牙髓细胞,来源于神经嵴的基质细胞。牙髓干细胞（human dental pulp stem cells,h DPSCs）是从牙髓组织中分离培养的一种成体干细胞,具有高度的增殖能力、自我更新能力和多向分化潜能。在一定条件下能够分化为成牙本质细胞,产生修复性牙本质,为保存活髓以及应用牙髓再生等组织工程学方法治疗牙髓病变提供了生物学基础。浓缩生长因子（Concentrated Growth Factors,CGF）为第三代血小板富集物。CGF利用特制的离心机通过变速离心使血小板破碎后释放出更多的生长因子,纤维蛋白的拉伸强度及黏合度均优于以往的血液凝集物,能够形成纤维蛋白的三维立体网状结构,这种多孔状的结构保护生长因子避免水解,使生长因子缓慢持续释放,为细胞生长提供了物理支架,促进了细胞的附着,迁移以及分化。CGF已经广泛应用于骨和其他再生医学,而CGF对于牙髓干细胞增殖分化的作用还没有相关研究,本课题对于CGF应用于牙髓组织工程具有重要指导作用。牙齿受到外伤意外露髓或深龋造成穿髓后,如果采取不恰当的治疗可能导致牙髓不可逆的损伤。临床上采取直接盖髓的方法对暴露的牙髓进行保护和诱导,促进牙髓细胞的分化,保持牙髓的活力。盖髓术利用盖髓剂使牙髓在损伤处形成牙本质桥,隔绝外界刺激保护健康的牙髓,但远期又会导致牙髓的变性和弥漫性钙化,甚至髓腔和根管的闭锁。是否能够利用自体CGF的优良特性,研究其应用于盖髓的可能,对于指导临床提高盖髓成功率有巨大的意义。年轻恒牙牙髓坏死后由于根尖孔尚未闭合,根管治疗对于牙体牙髓医生就成为了一个巨大的挑战。传统的根管治疗或根尖成形术由于不能刺激根尖缩窄以及根管壁厚度的增加,后期容易导致牙体的折裂,最终可能使患牙拔除。近年来,由于牙髓再生基础及临床研究的逐步深入以及越来越多的成功经验,牙髓再生治疗逐步发展为一种可行的方法。本研究将CGF应用于临床牙髓血管再生的病例,观察其对于牙髓再生的作用,对于指导临床牙髓血管再生的治疗,促进牙根继续发育,最大限度保存牙齿有重要作用。TAZ（transcriptional co-activator with PDZ-binding motif,又称WWTR1）是Hippo信号通路下游的一个转录共激活因子,经由自身固有的反式激活结构域作为一个转录调节子,可以与多种转录因子结合,并结合到相应启动子上,激活下游靶基因的转录,发挥调节细胞增殖、迁移和上皮间质转化等生物学作用,调控体内复杂的生理或病理过程。但TAZ对于牙髓干细胞增殖和迁移作用的研究还未见报道。综上所述,本研究检测了CGF对hDPSCs增殖分化的影响;以及CGF应用于直接盖髓动物实验的效果;其次观察了CGF应用于年轻恒牙牙髓血运重建病人的临床效果;最后分析了TAZ对hDPSCs增殖和迁移的影响,并探讨其可能存在的分子机制。本研究由四部分构成,各部分内容如下所述。第一部分CGF对牙髓干细胞生物学特性影响的体外实验研究目的:利用原代培养的人牙髓干细胞,制备浓缩生长因子（CGF）并观察其在体外对于牙髓干细胞增殖、迁移以及矿化的影响。方法:收集临床上25岁以下因正畸需要或阻生而拔除的牙周健康、无龋的前磨牙和智齿;取出牙髓组织,用胶原酶和Dispase消化后进行hDPSCs原代培养。收集对数生长期第三代hDPSCs进行流式细胞鉴定;成骨向分化能力及成脂分化能力鉴定;CCK-8法检测细胞增殖能力来验证培养的h DPSCs干细胞特性。抽取志愿者小臂静脉血9ml制备CGF凝胶,将凝胶压成膜状,剪至3×3mm²大小置于无菌生理盐水中备用。本实验分为4组,一个对照组,不加入CGF。三个实验组,分别为1片CGF组、2片CGF组、4片CGF组。通过CCK-8法检测CGF对牙髓干细胞增殖的影响;Transwell小室实验检测CGF对hDPSCs迁移能力的影响;茜素红染色观察CGF作用下牙髓干细胞矿化结节的形成情况;碱性磷酸酶活性（alkaline phosphatase,ALP）检测CGF对牙髓干细胞矿化的影响;Real-time PCR检测CGF对牙髓干细胞矿化诱导过程中矿化相关基因DSPP,DMP1,ALP,BSP的mRNA表达变化情况;Western blot检测牙髓干细胞矿化诱导过程中在CGF作用下,矿化相关基因ALP,DSPP,DMP-1蛋白表达水平。结果:倒置显微镜下观察原代培养hDPSCs呈长梭形、成纤维状。流式细胞检测细胞表面标志物CD34和CD45阴性表达,CD44和CD29阳性表达,表明培养的h DPSCs来源于间充质组织。hDPSCs经成骨诱导后茜素红染色可见有大量红色矿化结节形成。经成脂诱导后油红O染色可见细胞内及细胞间出现特异性的红色脂滴。细胞增殖曲线呈“S”型。表明培养的hDPSCs具有多向分化能力及干细胞特性。CCK-8结果显示CGF能够促进hDPSCs的增殖,Transwell检测结果显示CGF能够显著增加细胞的迁移数量,实验组h DPSCs穿出小孔细胞数量显著高于对照组。Real-time PCR结果显示实验组中DSPP,DMP-l,BSP,ALP的mRNA表达量均显著高于对照组（P<0.05）,且随时间增加和含量增大表达增强。其中DSPP在7d比14d时较对照组有更显著增高,DMP-1,ALP在14d时比7d时有显著增高。但在14d时4片CGF组反而出现下降,DSPP下降比较明显。Western blot检测结果显示,矿化诱导7d,14d后实验组中1片和2片CGF组DSPP,DMP-l,ALP表达量较对照组中明显上调,4片CGF在14d时反而出现下降,与PCR检测结果一致。小结:CGF能够促进hDPSCs的增殖和迁移。CGF能够促进hDPSCs的分化,能够促进矿化相关基因DSPP,DMP-1,ALP,BSP表达的增加。第二部分CGF用于直接盖髓的动物实验研究目的:通过观察氢氧化钙Ca（OH）₂,矿化三氧化物聚合体（MTA）,富自体纤维蛋白（CGF）三者在直接盖髓动物实验中的作用,探讨CGF应用于直接盖髓的可能性。方法:抽取Beagle犬后肢外侧小隐静脉血9ml,制取CGF膜,修剪成2×2mm²大小置于无菌生理盐水中备用。选取Beagle犬前臼齿共48颗牙齿,将牙齿随机分成4组,分别为MTA,CGF,Dycal,空白对照组;每组12颗牙。实验犬术前禁食水12h,术前30min犬后腿肌肉注射速眠新II镇静,给予戊巴比妥钠肌注加深麻醉,术区局部浸润注射盐酸利多卡因辅助麻醉。比格犬麻醉后固定于手术台,碘伏消毒,无菌橡皮障隔离实验牙,用高速涡轮手机在水喷雾冷却下,用高速锋利裂钻在实验牙磨平牙尖,咬合面开髓,当接近髓腔出现透红时,用小圆钻暴露牙髓,用无菌生理盐水冲洗窝洞,小棉球轻压擦干并止血。将盖髓剂轻置于穿髓孔处,勿压入髓腔,光固化树脂封闭窝洞。手术结束拍摄X线片。盖髓术后3个月将所有实验用牙拔出,固定、取材、脱钙、脱水、透明、包埋、切片及HE染色。在显微镜下进行观察评分。结果:X线结果显示,术后3个月Ca（OH）₂组可见有明显牙本质桥形成,髓腔缩窄,根管壁牙本质增厚。MTA组可见有牙本质桥形成,髓腔缩窄根管牙本质增厚,但程度较Ca（OH）₂组为轻。CGF组无明显牙本质桥形成,髓腔缩窄及根管牙本质增厚程度最轻。组织学观察结果显示Ca（OH）₂组在盖髓处形成明显牙本质桥,根管内牙髓纤维增生,成牙本质细胞消失。MTA组在盖髓剂下方可见明显牙本质桥,根管内牙髓纤维增生,充血,成牙本质细胞消失。CGF组在盖髓剂下方有少量牙本质桥形成,根管内成牙本质细胞排列整齐,可见前期牙本质形成,牙髓形态基本正常。小结:Ca（OH）₂和MTA作为传统的盖髓剂,能够有效达到直接盖髓的保髓效果。CGF用作直接露髓的盖髓剂,能够使牙髓保持正常生理状态,保持牙髓的正常结构和生理功能。第三部分CGF用于年轻恒牙牙髓再生修复的临床研究目的:将CGF应用于年轻恒牙的牙髓血管再生术,经过长期随访观察其效果,评价CGF应用于年轻恒牙牙髓坏死后牙髓再血管化及促进其牙根再发育的作用。方法:抽取需要治疗的患者静脉血9ml制备CGF膜,修剪成2×2mm²大小置于无菌生理盐水中备用。选取2015年11月²017年12月本院口腔内科门诊收治的12例年轻恒牙就诊患者,选择实验患牙均为年轻恒牙;牙齿发育处于Nolla分期的7,8或9期。患牙术前拍X线片,橡皮障隔离,高速手机开髓,清理根管内腐败坏死物,三联抗生素糊剂（甲硝唑,环丙沙星,头孢克洛）根管封药,复诊无症状者去除暂封物,超声根管荡洗根管彻底冲洗,无菌纸尖干燥,无菌#30K根管锉刺激根尖周组织出血,CGF膜用垂直加压器送入根管,放置到釉牙骨质界下方1mm,调和MTA充填于CGF上方封闭根管3mm,Cavit暂封,7d后复诊,如果没有症状及不适,复合树脂永久充填。患者在1,3,6,12,18,24个月时复诊,检查牙髓活力并拍X线片复查。结果:本研究一共12位患者14颗患牙,1位在治疗2个月后出现根尖感染改作根尖诱导术。共有11人13颗牙完成了牙髓血管再生治疗,经过8²4个月的随访观察。4颗患牙术后牙髓电活力测试显示牙髓出现活力,根尖周病变消失,牙根继续发育,根管壁增厚管腔变窄,牙根长度增长,根尖孔闭合;7颗患牙术后根尖周病变消失,牙根继续发育,牙根长度增长,根管壁增厚或根管影像模糊,根尖孔闭合;2颗术后根尖病变消失,牙根发育停止,根管壁及根尖孔无变化,总有效率为78.57%。小结:牙髓血运再生术是一种有效的年轻恒牙牙髓坏死的治疗方法,能够促进年轻恒牙牙根的继续发育、根尖孔的缩窄。CGF能够作为牙髓血运再生术的根管填充物,提高牙髓血运再生的治疗成功率。第四部分转录共激活子TAZ对牙髓干细胞增殖和迁移的影响目的:利用原代培养的人牙髓干细胞,观察转录共激活子在牙髓干细胞中的表达情况;通过分子生物学方法沉默TAZ后观察对牙髓干细胞增殖和迁移的影响,并探讨其作用机制。方法:通过免疫荧光实验检测牙髓干细胞中转录共激活子TAZ的表达;构建基因沉默工具siRNA并利用脂质体转染h DPSCs细胞,通过Real-time PCR及Western blot在mRNA水平和蛋白水平验证TAZ沉默效率;通过MTT和BrdU检测沉默TAZ后对hDPSCs增殖的影响;通过划痕实验和Transwell小室实验检测沉默TAZ后对hDPSCs迁移的影响;通过Real-time PCR及Western blot检测TGF-β通路在TAZ调节hDPSCs增殖和迁移中的作用。结果:细胞免疫荧光实验显示TAZ在hDPSCs中呈高表达的绿色荧光。Real-time PCR及Western blot结果在mRNA水平和蛋白水平显示TAZ沉默的有效性。MTT和BrdU结果显示沉默TAZ表达后抑制了hDPSCs细胞的增殖。划痕实验和Transwell小室实验结果表明沉默TAZ显著抑制了hDPSCs的迁移能力。Real-time PCR及Western blot结果显示沉默TAZ表达后CTGF和Cyr61的mRNA和蛋白水平显著降低。Western blot结果显示沉默TAZ表达TGF-β信号通路下游靶基因Smad3,Smad4,CTGF和Cyr61蛋白表达水平出现显著下降。小结:TAZ在h DPSCs细胞中高表达。沉默TAZ能够抑制体外hDPSCs细胞的增殖和迁移。TAZ通过TGF-β信号通路调节下游基因Smad3,Smad4,CTGF和Cyr61的表达,从而调控hDPSCs细胞的增殖和迁移。结论:1.CGF促进hDPSCs细胞的增殖和迁移。2.CGF促进hDPSCs的矿化,能够促进矿化相关基因DSPP,DMP-1,ALP,BSP表达的增加。3.CGF可以作为盖髓剂进行直接盖髓,促进牙髓的恢复,保持牙髓的正常生理功能。4.CGF可以作为牙髓再生修复的根管填充物,提高牙髓血运再生的成功率。5.TAZ在hDPSCs细胞中高表达。6.沉默TAZ能够抑制体外hDPSCs细胞的增殖和迁移。7.TAZ通过TGF-β信号通路调节下游基因Smad3,Smad4,CTGF和Cyr61的表达,从而调控hDPSCs细胞的增殖和迁移。