肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli,ExPEC)作为一种重要的人兽共患病病原和食源性致病菌而备受关注。它可通过污染食物、水源和饲料等造成传播,引起人和动物的肠外组织感染。而生物被膜形成增强了其多重耐药性和体内外抗逆特性,更增加其防控难度。因此,必须加强对细菌生物被膜形成机制及影响因子的研究,以便制定有效的防控策略。外膜蛋白TolC作为革兰氏阴性菌多种外排泵系统的主要组成部分,不仅介导进入细胞内的分子外排和自身代谢分子、毒素分子的外排,而且在维持外膜完整性和生物被膜形成过程中也具有重要的作用。本实验室前期研究表明TolC参与ExPEC对外界高渗环境的响应性,并通过调节Curli菌毛的合成而影响生物被膜的形成。从蛋白水平研究表明tolC基因缺失可导致外膜蛋白OmpX表达显著降低。OmpX作为毒力蛋白可参与细菌的致病过程,介导细菌对上皮细胞的黏附和入侵,并参与细菌对外界环境渗透压的适应性。是否OmpX介导TolC失活对ExPEC高渗环境响应性和生物被膜形成的作用?业已证明ompX缺失不影响ExPEC生物被膜形成,故本研究通过在△tolC突变菌株中导入OmpX过表达质粒,进一步探讨OmpX过表达对△tolC株生物被膜形成特性的影响。主要研究结果如下:1.高渗培养条件下ExPEC Omp X表达分析:qRT-PCR检测发现,在NaCl和蔗糖形成的高渗培养基条件下,ExPEC OmpX的表达量明显升高,提示OmpX表达可能是ExPEC对环境高渗应激的一种响应机制。2.OmpX过表达菌株的构建及其生物学特性的研究:构建了ompX全长基因表达质粒pHSG396:ompX,采用电转化方法分别导入ExPEC PPECC42野生株(WT)及其△tolC菌株,构建两种亲本株的OmpX过表达菌株。生长曲线结果表明,OmpX过表达不影响菌株在M9、1/2M9完全培养基和LB培养基中的生长速度。对试验菌株最低抑菌浓度(MIC)检测结果表明,TolC失活可造成ExPEC对环丙沙星、头孢噻肟、四环素、阿米卡星、SDS的耐药性得到明显改善,但TolC失活同时过表达OmpX时可恢复细菌对这几种药物的耐受性。体外细胞致病试验结果表明,tolC缺失引起ExPEC对人肺上皮细胞A549黏附侵袭能力和在小鼠巨噬细胞RAW264.7的存活能力显著减弱,但同时过表达OmpX后可部分恢复tolC缺失引起的这些作用。3.OmpX过表达对菌株生物被膜形成和Curli合成的影响:采用结晶紫染色法评价了试验菌株的生物被膜形成能力,结果表明在1/2M9低渗培养条件下,WT、△tolC及其OmpX过表达菌株均呈现强生物被膜形成能力;但在M9高渗培养基中,△tolC呈现弱生物被膜形成能力,但△tolC::ompX恢复了与WT相一致的强生物被膜形成能力。进而检测了试验菌株在1/2M9培养基中添加不同浓度NaCl或蔗糖形成高渗条件下的生物被膜形成能力,结果显示tolC缺失可导致Ex PEC生物被膜形成能力对高渗环境的抵抗能力减弱,但△tolC::ompX可部分或全部恢复菌株生物被膜形成能力对高渗环境的抵抗。Curli菌毛是ExPEC生物被膜形成的关键成分。本研究采用刚果红平板试验分析了试验菌株的Curli菌毛合成能力,结果显示:在M9培养基中,△tolC株呈现缺乏Curli菌毛的saw菌落表型,而△tolC::ompX株呈现与WT株相似的可形成Curli菌毛的rdar菌落表型;但在1/2M9培养基中试验菌株均呈现rdar菌落表型。进而qRT-PCR检测结果证实,OmpX过表达对△tolC株Curli菌毛合成能力的代偿是由于调控Curli合成相关基因csgB和csgD的转录水平。4.转录组学技术筛选TolC和OmpX调节生物被膜形成的靶标:为进一步探讨TolC和OmpX参与高渗环境抗性和生物被膜形成的分子机制,本研究采用RNA-seq技术从转录组学水平分析了高盐和高糖培养条件下WT、△tolC与△tolC::ompX菌株之间的差异表达基因,筛选到一系列生物被膜形成和细菌抗渗透性相关基因,包括转录调节因子、多压力反应蛋白Bhs A、以及cpx双组份信号系统辅助蛋白CpxP等。总之,ExPEC外膜蛋白OmpX可能通过上调表达响应环境应激,参与细菌生物被膜的形成;过量表达OmpX可弥补TolC缺失造成的细菌Curli菌毛和生物被膜形成能力的缺陷。根据转录组测序分析结果,过量表达OmpX对TolC缺失株高渗耐受性和生物被膜的补偿作用可能主要通过调节双组份系统和压力反应系统来完成。