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微丝在细胞内形成典型的高级结构,如微丝束,为胞内各运输事件提供分子轨道。其中在花粉管的槽部,微丝主要以与伸长轴相互平行的方式形成微丝束。迄今为止,花粉管胞质微丝束的组装和动态周转的分子机制人们还了解甚少。本研究以拟南芥花粉管为实验系统,综合利用遗传学、细胞生物学和生物化学的手段解析微丝束的产生和动态解聚的分子机理。
首先,我们发现花粉特异表达的AtAFH3编码一个肌动蛋白成核因子,控制花粉管槽部微丝束的形成。AtFH3基因编码一个含有785个氨基酸的蛋白,其中含有formin同源物1(FH1)和formin同源物2(FH2)两个结构域。体外生化分析表明,AtFH3FH1FH2不仅能够促进G-actin和G-actin-profilin复合体的成核,而且还能结合微丝的正末端。与生化结果吻合的是,我们发现在烟草花粉管中过量表达AtAFH3会增加花粉管的微丝束,而且这些微丝束能够进入花粉管的顶端区域。相反,在拟南芥花粉管中将AtFH3的表达量特异下调,不仅会减少花粉粒中微丝的含量,而且还会使花粉管槽部的微丝束数量变少。AtFH3RNAi花粉管为检测微丝束和胞质环流的关系提供了很好的实验材料,观察发现在AtFH3RNAi花粉管中典型的倒喷泉环流方式发生紊乱,这表明微丝束对于花粉管正常的胞质环流是至关重要的,为微丝束调控胞质环流提供了直接的遗传学证据。同时,我们还发现突变体的花粉管变得既短又粗,而且有些花粉管的顶端区域会发生膨大,这表明胞质微丝束参与调控花粉管的极性生长。
其次,为了解析花粉管中微丝束的动态周转,我们对花粉特异表达的ADF/cofilin家族的成员AtADF7的功能和作用机制进行了分析。AtADF7基因编码一个含有137个氨基酸的蛋白。体外生化分析表明AtADF7倾向于结合ADP-G-actin,并且能促进微丝的解聚。与生化性质一致的是,AtADF7功能缺失的突变体花粉管的微丝含量增加。对花粉管中微丝动态的直接观察发现adf7突变体花粉管与野生型花粉管相比微丝切割频率变慢。与野生型相比,adf7突变体花粉管的生长速率减缓,表明微丝束的动态解聚参与调控花粉管的极性生长。进一步的实验发现adf7突变体花粉粒的萌发比野生型花粉粒更能抵抗微丝解聚剂LatrunculinB的处理。值得一提的是,与生化性质分析相对清楚的另一个ADF异构体AtADF1相比,在pH8.0下,AtADF7的微丝解聚活性较弱;但在pH6.5下,二者的微丝解聚活性相当;这暗示着在进化上,AtADF7可能更好地在花粉管槽部相对较低的pH环境中发挥功能。考虑到ADF往往能同时切割微丝和促进单体肌动蛋白从微丝负端解离,为了进一步检测ADF在不同pH条件下对微丝切割事件的影响,我们采用了全内反射荧光显微镜对单根微丝的行为进行了观察,结果发现AtADF7和AtADF1在低pH下都表现出比在高pH下更强的微丝切割活性,ADF的微丝切割活性响应pH的性质可能具有普遍意义。
综上所述,本研究发现AtFH3通过控制微丝成核调控微丝束的形成,而AtADF7则参与调控花粉管微丝束的动态解聚。相关研究丰富了人们对微丝骨架调控花粉管生长的分子机制的理解,同时对于理解其他细胞微丝骨架的组装和动态周转的分子机制可能具有普遍意义。