本文改进了一种可以利用错配修复蛋白TthMutS直接从细菌基因组中检测出未知突变的方法。利用这个方法，我们检测了一株具有氯霉素高水平抗性表型的铜绿假单胞菌突变株中存在的突变，表明氯霉素乙酰基转移酶catB7基因中181位和314位的A/G转换使该菌株呈现了高水平氯霉素抗性。对氯霉素乙酰基转移酶CATB7蛋白突变体的进一步研究表明，突变体比活性未见提高，但增加了它在细胞内的累积量，初步揭示了该铜绿假单胞菌突变株对氯霉素抗性水平提高的分子基础。 考虑到错配修复蛋白MutS是DNA错配修复系统中最关键的起识别和结合错配的作用的一个蛋白，近年来开发出一系列基于大肠杆菌MutS蛋白的突变检测方法。然而，这些方法大多是设计用来检测合成的寡核苷酸片段或者PCR扩增片段中的已知突变，这就大大限制了这些方法的实用性。此外，体外试验表明，大肠杆菌MutS蛋白并不能有效区分所有错配类型。而来源于嗜热微生物Thermusthermophilus的错配修复蛋白TthMutS，能在高达60℃的温度范围内有效识别所有8种类型的碱基错配和1到3个碱基的缺失或者插入引起的错配，因而在突变检测中有更大的潜力。 我们介绍了一种可以利用TthMutS直接从细菌基因组中检测出未知突变的方法。野生型的基因组DNA和突变型的基因组DNA混合在一起，经限制性内切酶消化后变性再复性，所产生的含有错配碱基的异源双链DNA片段用TthMutS来结合，并经Ni-NTAHis-Bind()树脂亲和层析来回收。回收的DNA片段克隆到载体中，形成一个含有错配片段的微型文库。进一步的DNA测序和遗传互补实验证实了该方法在从细菌的基因DNA中检测未知突变是有效的。利用这个方法，我们检测了一株具有氯霉素高水平抗性的铜绿假单胞菌突变株中存在的突变，表明氯霉素乙酰基转移酶catB7基因中181位和314位的A/G转换使该菌株呈现了高水平氯霉素抗性。同以前同类方法相比，该方法能够比较容易地在基因组范围内检测未知突变，传统的依赖于PCR扩增、凝胶电泳或构象变化的突变检测方法是不适用这个目的的。传统的细菌遗传学产生了大量表型已知而基因型未知的突变菌株，本文发展的方法在鉴定这些突变菌株的基因型方面将发挥很大的作用。 氯霉素乙酰基转移酶基因cat在大多数革兰氏阴性菌和阳性菌中都存在，CAT蛋白通过乙酰化作用失活氯霉素，这是细菌抗抗生素机制中了解得最为清楚的一种途径。我们在一株具有高水平氯霉素抗性表型的铜绿假单胞菌中，检测到catB7基因存在了两个点突变，181A/G和314A/G，它们分别引起G61S和Y105C氨基酸替换，并且证实了catB7突变基因是菌株高水平氯霉素抗性表型的主要决定子。我们进一步从体外表达测活和体内遗传互补几方面来鉴定这个突变基因的性质，以期揭示这个抗性表型的分子基础。 从野生型和突变型铜绿假单胞菌中分别扩增catB7基因，克隆到表达质粒pET28a中，形成表达质粒pETPaCATw和pETPaCATm，并利用定点突变获得表达质粒pETPaCATm181和pETPaCATm314。采用IPTG诱导表达、变性纯化和复性获得野生型和突变体氯霉素乙酰转移酶重组蛋白CATB7、CATB7G61S,Y105C、CATB7G61S和CATB7Y105C。活性测定表明这四个重组蛋白的比活性和动力学参数非常接近。与此相吻合的是，从最近发表的氯霉素乙酰基转移酶的晶体结构可以看出，这两个突变位点并非处于酶活性中心。通过构建自杀质粒、定点突变和遗传互补获得了catB7基因含有181A/G或314A/G单点突变的铜绿假单胞菌衍生菌株PAcr181和PAcr314。氯霉素敏感性测定表明，四株铜绿假单胞菌PAO1、PAcr181、PAcr314和PAhcr1的氯霉素抗性水平依次升高。Western点印迹则显示在这四株铜绿假单胞菌中氯霉素乙酰基转移酶蛋白积累量也依次升高，与各自的氯霉素抗性水平正相关。由这些结果可以推测，非酶活性中心位点的氨基酸替换引起氯霉素乙酰基转移酶突变体在结构上发生了细微变化，可能具有不同程度的抗蛋白酶降解水平。