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先前发现利用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)进行重编程中伴随间质-上皮转化(MET);并阐明了重编程因子通过抑制TGF-β通路,从而抑制上皮-间质转化(EMT),Klf4具有刺激上皮细胞标识基因E-cadherin表达的作用,从而驱动MET发生;抑制MET过程抑制重编程发生,而促进MET过程提高重编程效率,并可建立无Sox2的iPSCs。因此MET过程是重编程必需的。为了深入研究这一现象,本论文利用原代分离的小鼠乳腺上皮细胞(MECs)进行重编程研究。第一,原代分离的MECs具有诸多上皮细胞特性,相比MEF细胞具有较高的重编程效率,来自MECs的iPSCs具有多能性。第二,MECs的重编程效率与原代培养以及重编程中的培养体系相关,特别是在低血清并添加抑制TGF-β通路的Alk5抑制剂(Alk5i)的条件下获得最高的效率。第三,MECs在以上不同培养条件下内源Klf4基因表达呈现相对应的特征,即血清抑制其表达,血清添加Alk5抑制剂可以维持其表达,据此发现维持内源Klf4可以实现无外源Klf4的重编程(SO+Alk5i),这些SO+Alki的iPSCs具有多能性。
本论文同时对MET相关的miRNAs在重编程的效应及机制进行了初步研究。已有实验结果显示,第一,miR-200C显著抑制重编程发生,主要通过抑制细胞增殖来实现这一效应。第二,这一效应主要通过其在重编程细胞中上调衰老相关基因p53的mRNA以及蛋白表达实现。第三,miR-200C虽然引起MET(抑制Zeb1和2、刺激E-cadherin表达),但其刺激细胞衰老的效应对重编程的影响占据主导作用。第四,利用p53缺失小鼠的尾尖成纤维细胞(TTF)研究发现,miR-200C的抑制细胞衰老效应消失,对重编程不再呈现抑制作用。本论文通过对MET相关miRNA的研究,发现了在重编程中MET过程与细胞衰老之间存在密切的调控关联。
本论文同时利用从小鼠乳腺原代培养分离的乳腺成纤维(MaF)细胞进行了重编程研究。已有实验结果显示,第一,MaF细胞对Vc和Alk5i具有与MEF相似的敏感性;相比MEF的四因子(SKOM)重编程,MaF体现出对Vc更加敏感。第二,来自MaF细胞的前体诱导重编程细胞(pre-iPSCs)在Vc处理后体现出迅速转变为完全的iPSCs的效应。第三,Vc处理转变后的MaF的iPSCs具有多能性。第四,早期SKOM+Vc的MaF的iPSCs克隆的状态不稳定,Vc有助于其状态维持。因此,本论文发现原代培养获得的MaF细胞体现了对Vc独特的敏感性,特别有利于研究Vc对重编程的效应以及机制。
综上所述,本论文在深入探究重编程中MET分子机制的同时,初步发现了MET与细胞衰老在miRNAs调节水平的密切关联,并意外发现了MaF细胞在重编程中对Vc的独特敏感性。这些工作将继续推动实验室在重编程分子机制研究中对MET过程和Vc的机制的深入工作。