糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）作为2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）主要的微血管并发症,是导致患者致盲的首要原因,且DR缺乏有效的治疗手段,势必对个人、家庭、社会构成巨大的经济负担。因此,预防DR并揭示其致病机制具有重要的战略意义。近年来,我国DR的患病形势不容乐观,有赶超发达国家的趋势。我国DR患病率存在地域差异,且具有农村高于城市,北方高于南部及东部沿海的特点。云南省位于中国西南高原地区,具有独特的地域、人文结构。前期的调查研究发现,相较于其他地区,云南省T2DM患者的DR患病率高于全国平均水平。因此,云南省DR的防治任务异常艰巨,积极寻找云南省DR的相关危险因素,并制定临床决策模型迫在眉睫。DR复杂的致病机制尚未完全阐明。现有证据显示DR可受到来自基因和环境因素的双重“压力”。因此,除外揭示DR相关的风险临床因素,进一步寻找能够集云南省地理环境、基因遗传特征于一身的因素,并探究该因素与DR的相关性显得尤为必要。既往研究显示线粒体不仅与视网膜密切相关,亦是沟通基因遗传和地域环境的关键“环节”。视网膜是人体集血管,神经系统为一体的特殊器官,需消耗大量的三磷酸腺苷以维持视觉功能。作为细胞能量代谢的重要场所,正常的线粒体的功能对维持视网膜的正常代谢至关重要。线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）突变引起的线粒体功能障碍被证实与DR有关。此外,由于缺乏组蛋白的保护,mtDNA极易突变。人类祖先在向世界各地迁移时,在适应自然环境的过程中使得一些古老的mtDNA变异不断积累,最终形成的特定mtDNA遗传背景,即mtDNA单倍型类群。近年的研究证实mtDNA单倍型类群具有功能性的后果,多与能量代谢性疾病有关,并受到地域、种族等因素的影响。截止目前,mtDNA单倍型类群与DR的研究主要局限于欧美国家,且结果尚存争议。更重要的是,相关研究在我国鲜有报道。因此,结合云南省独特的地理人文背景,进一步探究mtDNA单倍型类群与DR的相关性,并揭示其潜在的致病机制具有重要意义。综上,本研究本从以下三个阶段开展。第一阶段,揭示云南省DR的相关危险因素,并构建临床决策模型。第二阶段,在第一阶段样本的基础上,筛选与云南省DR相关的mtDNA单倍型类群,即候选单倍型类群。第三阶段,通过比较候选单倍型类群与对照单倍型类群融合细胞的线粒体功能,并进行点突变和转录组测序分析,揭示候选单倍型类群在DR中的相关分子机制。总之,从临床研究过渡到基础研究,层层递进,不断丰富DR的致病机制。第一部分云南省糖尿病视网膜病变的相关危险因素分析及临床决策模型构建[目 的]揭示云南省T2DM患者DR的相关危险因素,并构建临床决策模型。[方 法]入组1654名汉族T2DM患者,依据眼底照相结果分为:无视网膜病变（without DR,WDR）组（n=826）,DR 组（n=828）。DR 组依据病变严重程度进一步分为:非增殖性糖尿病视网膜病变（non-proliferative diabetic retinopathy,NPDR）组（n=403）,增殖性糖尿病视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy,PDR）组（n=425）。采集患者临床资料,采用SPSS 20.0软件进行单因素和logistic回归分析,并构建临床决策树模型。[结 果]1.单因素分析显示,与WDR组相比,DR组的女性占比,糖尿病病程,卧位或立位收缩压（systolic pressure,SBP）,卧位舒张压（diastolic pressure,DBP）,胆固醇（cholesterol,Chol）,尿素氮（bloodureanitrogen,BUN）,尿酸（uric acid,UA）,血肌酐（serumcreatinine,Scr）,空腹血糖及糖化血红蛋白（hemoglobin A1c,HbA1c）均显著升高（all P<0.05）;体重指数（body mass index,BMI）,臀围和预估肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate,eGFR）均显著下降（all P<0.05）。与NPDR组相比,PDR组的女性占比,卧位SBP,卧位DBP,Chol,低密度脂蛋白-胆固醇及BUN均显著升高（all P<0.05）,而年龄,臀围及eGFR均显著下降（all P<0.05）。2.Logistic回归分析显示,女性（优势比（oddsratio,OR）=1.520）,糖尿病病程≥10 年（OR=2.118）,立位或卧位 SBP≥ 140 mmHg（OR=1.417,OR=1.881）,Chol≥6.22 mmol/L（OR=1.591）是T2DM患者发生DR的风险因素。此外,慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）分期或HbA1c风险等级每增加一个等级,T2DM患者发生DR的风险逐级增加。此外,女性（OR=2.161）,糖尿病病程≥10年（OR=1.483）,CKD分期等级的增加亦是NPDR患者进展为PDR的风险因素。3.决策树模型中,糖尿病病程是影响T2DM患者发生DR的首要危险因素,即根节点。CKD分期,卧位SBP,立位SBP和BMI是内部节点,是否合并DR为叶节点。提取规则后解释为:对于糖尿病病程<10年的患者,若满足:①CKD分期=G3/G4/G5;或②CKD 分期=G2 且 BMI<24 kg/m2;或③CKD 分期=G1且立位SBP≥140mmHg,则容易发生DR。反之,对于糖尿病病程≥10年的患者,若满足:①卧位SBP<140 mmHg且CKD分期=G2/G3/G4;或②卧位SBP≥140 mmHg且CKD分期=G3/G4/G5,则容易发生DR。[结 论]女性,糖尿病病程≥10年,立位或卧位SBP≥140mmHg,Chol≥6.22 mmol/L,CKD分期和HbA1c风险等级的恶化是云南省汉族T2DM患者发生DR的重要危险因素。此外,本研究制定的决策树模型显示,对T2DM患者进行DR患病风险评估时,应首先考虑糖尿病病程。若糖尿病病程<10年,则依据CKD分期进一步评判立位SBP或BMI;若糖尿病病程≥10年,则依据卧位SBP进一步评判CKD分期,最终得出DR的分类结局。该模型简洁直观,能帮助云南地区的临床医生（尤其是缺乏眼底镜等相关DR检测手段的基层医务人员）对T2DM患者发生DR的风险做出更有效的临床预测,值得在未来的临床实践中推广。第二部分 云南省糖尿病视网膜病变的相关mtDNA单倍型类群及mtDNA单核苷酸变异位点分析[目 的]筛选与云南省T2DM患者DR相关的mtDNA单倍型类群及mtDNA单核苷酸变异位点。[方 法]依据眼底照相结果,将832名T2DM患者（均来自第一部分）分为WDR组（n=403）,DR组（n=429）。DR组依据病变严重程度进一步分为NPDR组（n=227）,PDR组（n=202）。首先,提取患者外周血基因组DNA,对mtDNA进行测序后划分患者的mtDNA单倍型类群。然后,采用SPSS 20.0软件进行如下统计学分析:①对入组患者的临床基线资料进行单因素分析,明确第二部分的受试人群能总体代表第一部分的受试人群。②依据mtDNA单倍型类群分布频率绘制主成分分析图。③采用logistic回归分析明确与DR相关的风险mtDNA单倍型类群,即候选单倍型类群。④比较候选单倍型类群与其他单倍型类群临床参数的差异。⑤分析mtDNA控制区单核苷酸变异位点与DR之间的关联。[结 果]1.单因素分析显示,DR组的年龄,糖尿病病程,臀围,卧位SBP,空腹血糖,HbAlc,Chol,BUN,UA,Scr 均与 WDR 组差异显著（all P<0.05）,且结果与第一部分的研究结果一致,提示该部分受试者的临床数据具有良好的稳定性。2.832例T2DM受试者大致可分为40类mtDNA单倍型类群。其中,分布频率≥3%的mtDNA单倍型类群包括:单倍型类群A、B、C、D、R9、M*、M7、M9 和 N9。3.主成分分析显示,尽管mtDNA单倍型类群在中国西南省份内紧密聚集,但没有明显的群体分层现象。中国南部和西南部的mtDNA单倍型类群分布较东部和东北部更为复杂。4.Logistic回归分析显示,单倍型类群M9是DR的独立保护因子（P=0.004,OR=0.1）。5.与其他non-M9单倍型类群受试者相比,单倍型类群M9受试者的Chol浓度显著降低（P=0.042）。即使在WDR受试者中,单倍型类群M9受试者的Chol浓度也明显低于non-M9单倍型类群者（P=0.038）。6.mtDNA控制区的3个单核苷酸变异位点,即mt.T146C、mt.T16298C和mt.C16327T 与 DR 相关（all P<0.05）。[结 论]中国南方和西南地区mtDNA单倍型类群分布较华东和东北地区更为复杂。本研究首次发现单倍型类群M9是云南省T2DM患者发生DR的独立保护因素。本研究中的单倍型类群M9受试者的Chol总体低于单倍型类群non-M9受试者。第三部分M9与non-M9融合细胞的线粒体功能比较及转录组分析[目 的]比较M9与non-M9融合细胞的线粒体功能,并进行点突变和转录组测序分析,揭示单倍型类群M9作为DR保护因子的分子机制。[方 法]首先,依据既往文献,将糖脂代谢不相关的mtDNA单倍型类群作为单倍型类群M9的对照,即non-M9。通过胞质融合技术构建M9和non-M9融合细胞,进一步比较融合细胞的线粒体功能。其次,构建mt.T3394C和mt.G4491A突变质粒,分别转染non-M9融合细胞。依据质粒种类,实验分为正常对照（normal control,NC）组、空载体（Vector）组、野生型（wide type,WT）组和突变型（mutant type,MUT）组,观察 mt.T3394C 和 mt.G4491A 突变对 M7融合细胞线粒体功能的影响。最后,提取M9和non-M9融合细胞的RNA进行转录组分析。[结 果]1.以单倍型类群M7和D5（与糖脂代谢不相关）作为单倍型类群M9的对照,即 non-M9。2.成功构建M9和non-M9（M7,D5）融合细胞。融合细胞线粒体相关功能检测显示,M9融合细胞的线粒体膜电位和线粒体质量显著高于M7融合细胞（P<0.001）,但与D5融合细胞无显著性差异（P>0.05）。ATP含量在M9,M7和D5融合细胞间无显著性差异（all P>0.05）。M9融合细胞的胞浆活性氧（reactive oxygen species,ROS）和线粒体超氧化物水平显著低于M7和D5融合细胞（all P<0.01）。3.成功构建mt.T3394C突变质粒转染M7融合细胞。MUT组的胞浆ROS水平显著低于NC组,WT组和Vector组（all P<0.05）。MUT组的线粒体超氧化物水平均显著低于Vector组和WT组（all P<0.001）,但高于NC组（P<0.001）。4.成功构建mt.G4491A突变质粒转染M7融合细胞。MUT组的胞浆ROS水平显著低于WT组和Vector组（all P<0.001）,高于NC组（P<0.001）。MUT组的线粒体超氧化物水平高于NC组和Vector组（all P<0.01）,但与WT组无显著差异（P>0.05）。5.转录组分析显示,与non-M9（M7,D5）融合细胞相比,M9融合细胞中有 892 个差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,其中 450 个基因上调,442个基因下调。上述DEGs的基因本体（Gene Ontology,GO）功能注释主要聚焦于细胞成分。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集分析显示,上调的DEGs富集于5条通路,下调的DEGs富集于3条通路。其中,4条通路（PI3K-Akt signaling pathway,ECM-receptor interaction,HIF-1 signaling pathway 和 NF-kappa B signaling pathway）与DR相关。对极端差异的DEGs（满足错误发现率<0.05且差异倍数≥2）进行聚类分析,显示有6个基因上调,9个基因下调。其中,NRCAM和ADAMTSL3在视网膜表达。[结 论]与non-M9（M7,D5）融合细胞相比,M9融合细胞的胞浆ROS和线粒体超氧化物水平较低,且与DR致病相关的关键信号通路以及核基因的表达亦显著下调,提示单倍型类群M9在DR的形成中发挥重要作用。此外,单倍型类群M9特有的突变mt.T3394C可有效降低M7融合细胞的胞浆ROS和线粒体超氧化物水平,提示该突变部分介导了单倍型类群M9对DR的保护。