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缺血性中风是指突然发生的脑血流供应障碍引起缺血缺氧,导致局限性脑组织缺血性坏死或脑软化的疾病。如果缺血性中风在最佳治疗时间窗内得不到有效治疗,严重者会留下视力障碍、语言丧失、瘫痪和意识错乱等不同程度的功能障碍,甚至导致死亡,严重危害人类的健康。中医药防治缺血性中风有独特优势,且医学界已公认缺血性中风是中医学防治的优势病种。课题组在研究缺血性中风方面已积累了经验,发现清开灵、精制清开灵对缺血性中风模型大鼠有很好的疗效,其中栀子、栀子苷作为主要成分发挥了重要作用。缺血性中风的发病过程中,除了炎症、局部淤血刺激以外,神经细胞损伤、凋亡是非常重要的发病环节。并且在脑缺血后由于能量障碍引起的神经细胞损伤、凋亡的机制研究中,内质网应激、自噬所扮演的角色越来越受到重视。内质网应激与自噬在缺血性中风的病理机制中各自独立却又密切联系,目前多数研究认为,内质网应激可以促进自噬流,反过来,自噬可以减弱内质网应激。这可能与自噬清除多余的废弃蛋白从而减弱内质网应激有关。目前有一种假说认为自噬通过减弱过度的内质网应激从而对抗神经元凋亡。本课题主要从细胞水平研究栀子及其代表性成份栀子苷对能量障碍损伤的神经细胞的保护作用,并初步探讨栀子苷对细胞凋亡、内质网应激、自噬的调节机制,希望为栀子、栀子苷的神经保护作用提供更多的科学依据。1目的1.1摸索栀子水提液、梔子苷对SH-SY5Y细胞毒性及其给药剂量范围1.2观察栀子水提液、栀子苷对正常及OGD-Rep损伤的SH-SY5Y细胞的保护作用。1.3探讨栀子苷的神经保护作用是否与抗凋亡、干预内质网应激、自噬相关。2方法2.1利用人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y建立OGD-Rep模型2.2运用CCK-8法检测细胞存活率2.3 JC-1染色检测细胞凋亡情况。Western blot法检测caspase12蛋白表达。2.4 Western blot 法检测 Bip/GRP78、CHOP 蛋白表达。2.5 吖啶橙(Acridine Orange,AO)、MDC(Dansylcadaverine)荧光染色法检测细胞内自噬水平。间接免疫荧光法检测各组细胞LC3Ⅱ、P62蛋白表达,Western blot法检测LC3Ⅱ、P62蛋白表达。3结果3.1栀子水提液、栀子苷的细胞毒性检测3.1.1 CCK8法检测细胞活力结果显示,0.1 μ g/mL、1 μ g/mL低浓度的栀子水提液可提高正常细胞的活性,促进其生长(P<0.05);而2000 μg/mL栀子水提液对正常细胞表现出抑制作用(P<0.001)。3.1.2 CCK-8检测结果显示,栀子苷各浓度组细胞活力与正常组比较无显著差异。3.2对糖氧剥夺-复糖复氧(OGD-Rep)细胞模型的活力影响3.2.1栀子水提液、栀子苷对OGD12h-Rep2h细胞模型的活力影响① 10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL 栀子水提液组细胞活力较模型组细胞活力显著增强(P<0.05),并且细胞活力的增强与药物的浓度有剂量依赖性关系,栀子水提液的浓度越高,细胞活力增强越明显。②1μg/mL栀子苷、10μg/mL栀子昔组细胞活力与模型组无显著差异,100μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL栀子苷组细胞活力较模型组增强,有统计学差异(P<0.05)。3.2.2梔子苷对不同时间OGD-Rep诱导损伤的细胞活力影响。①OGD6h-Rep2h,细胞损伤程度非常轻,1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL的栀子苷组与模型组比较细胞活力显著增强(P<0.05),500 μ g/mL栀子苷组、1000 μ g/mL栀子苷组及阳性药依达拉奉组细胞活力与模型组比较没有显著增强。②OGD9h-Rep2h,损伤程度较6h重,此时阳性药依达拉奉依然没有表现出保护作用,1μg/mL栀子苷的保护作用消失,10μg/mL栀子苷组、100μg/mL栀子苷组、500μg/mL栀子苷组、1000 μg/mL栀子苷组与模型组比较细胞活力显著增强P<0.05),且随着栀子苷浓度的增高,对SH-SY5Y保护作用越明显。③OGD11h-Rep2h,损伤程度较9h更重,阳性药依达拉奉组细胞活力高于模型组,1 μ g/mL梔子苷的保护作用消失,10μg/mL梔子苷组、100μg/mL栀子苷组、500μg/mL梔子苷组、1000 μg/mL栀子苷组与模型组比较活力显著增强(P<0.05),且随着栀子苷浓度的增高,对SH-SY5Y保护作用越明显。3.3栀子水提液与栀子苷的药效对比用高效液相法测得栀子水提液中栀子苷含量占16.7%,由此换算出500 μ g/mL浓度的栀子水提液与83.5 μg/mL浓度的栀子苷在栀子苷的含量上具有等量关系。CCK-8检测显示,500 μ g/mL浓度的栀子水提液的保护作用比83.5 μ g/mL浓度的栀子苷的保护作用要强(P,0.001)。3.4机制研究3.4.1抗凋亡。细胞凋亡JC-1染色显示,栀子苷可以减少OGD12h-Rep2h诱导的细胞凋亡。Western blot结果显示,模型组凋亡相关蛋白caspase12表达量较正常组明显增高(P<0.001),500μg/ml栀子苷组、100μg/ml栀子苷组、10μg/ml栀子苷组细胞凋亡较模型组低(P<0.01)。3.4.2内质网应激Western blot结果:模型组中内质网应激相关蛋白CHOP、GRP78/Bip表达量较正常组明显增高(P<O.001),10μg/ml栀子苷组、100μg/ml栀子苷组、500μ g/ml栀子苷CHOP、GRP78/Bip表达量则较模型组低(P<0.01)。3.4.3自噬采用吖啶橙(AO)染色的方法评价自噬水平,结果表明,正常组荧光显示绿色荧光信号,表明没有明显的自噬,模型组及10μg/ml、10μg/ml、500μg/ml栀子苷组均表现出明显的红色荧光,以模型组红色荧光最明显,500 μg/ml栀子苷组红色荧光较模型组明显减少,10μg/ml栀子苷组与10μg/ml栀子苷组差异不明显。改用MDC染色的方法评价自噬水平,结果表明,正常组荧光较其余各组弱,且荧光呈现出弥散状态。模型组荧光最强,尤其是核周荧光浓聚点多,栀子苷各给药组荧光较模型组弱,荧光浓度较浅。间接免疫荧光检测LC3Ⅱ结果:正常细胞胞浆内有少量的绿色荧光,模型组胞浆内的绿色荧光较正常组聚集增多,荧光信号比正常组细胞强;500 μg/ml栀子苷给药组绿色荧光信号较模型组弱,10μg/ml、10μg/ml栀子苷组荧光信号较模型组稍弱。间接免疫荧光检测P62结果:正常细胞内有明显的的绿色荧光信号,模型组胞浆内的绿色荧光较正常组减少;500μg/ml、10μg/ml栀子苷给药组绿色荧光信号较模型组强;100 μg/ml栀子苷给药组荧光信号较模型组增强不明显。Western blot结果:模型组自噬相关蛋白LC3Ⅱ表达量较正常组增高,500μg/ml栀子苷组蛋白表达较模型组降低(P<0.05),10 μg/ml栀子苷组、100 μg/ml栀子苷组中LC3Ⅱ表达量较模型组有降低的趋势,但没有统计学差异。模型组自噬相关蛋白P62表达量较正常组降低,500μg/ml栀子苷组蛋白表达较模型组升高,具有统计学差异(P,0.05),1000μg/ml栀子苷组、10 μg/ml栀子苷组P62蛋白表达量较模型组高,但没有统计学差异。4结论4.1栀子水提液对SH-SY5Y细胞有促生长作用。4.2栀子水提液、栀子苷对OGD-Rep诱导损伤的SH-SY5Y细胞有保护作用,栀子神经保护作用强于栀子苷。4.3栀子苷对OGD-Rep损伤的SH-SY5Y细胞的保护作用可能通过抑制内质网应激从而抑制凋亡而实现。4.4栀子苷可降低OGD-Rep损伤的SH-SY5Y细胞内自噬水平。