烟曲霉是一种丝状真菌,广泛存在于我们生活的环境中,其孢子播散在土壤和空气中。烟曲霉是一种重要的致病真菌,可以感染人和动物的肺部和其他器官,引起过敏症状、慢性曲霉肿以及侵袭性曲霉病。目前随着免疫抑制剂、细胞毒药物和广谱类抗生素在临床治疗中的广泛应用,免疫缺陷患者逐年增多,罹患侵袭性曲霉病的机率也在增多,尤其是肺曲霉病患者肺部组织破坏严重,病情进展迅速,治疗困难,病死率高（可高达90%）。烟曲霉致病性由多种因素共同决定,包括表面结构、适应外界应激的能力、逃避宿主免疫系统的机制以及通过毒素、蛋白酶对宿主造成损害的能力等。当烟曲霉孢子随着空气被吸入到肺部,细胞壁是其接触并侵入宿主细胞及组织的首要致病因素,也是病原真菌对抗宿主防御机制的重要武器。β-1,3-葡聚糖是所有真菌细胞壁的主要组成部分,也是一种病原模式识别分子,主要由β-1,3-葡聚糖合成酶催化合成,而小G蛋白Rho1是该酶的调节亚基。由于无法获得烟曲霉rho1基因完全敲除株,Rho1蛋白在细胞壁生物学特性、致病力及诱发宿主天然免疫应答中的功能及具体分子调控机制均不清楚。因此,本论文目的就是研究Rho1对烟曲霉细胞壁表面特征、主要结构成分及药物敏感性的影响规律,探讨Rho1可能参与的信号通路,然后从细胞水平和动物水平上解析Rho1对烟曲霉致病性和诱导宿主天然免疫应答的调节机制。这将有助于全面揭示Rho1蛋白在烟曲霉感染及宿主天然免疫应答中的功能,为寻找可能的药物研发靶点提供重要科学依据。烟曲霉rho1基因大小为950bp,位于第六条染色体上,包括了5个外显子,编码的Rho1蛋白为21.5 kDa,一共有200个氨基酸残基,对Rho1蛋白进行序列比对分析,烟曲霉Rho1与人中的RhoA的亲缘关系距离大于0.323,与酵母中Rho1的亲缘关系距离为0.065。为了进一步研究Rho1的功能,我们尝试了许多方案去构建rho1基因的完全敲除株,但是一直发生异位重组,结合之前的报道,判断Rho1可能是烟曲霉的必需蛋白。因此我们转换策略,利用依赖多西环素的表达控制元件,构建了烟曲霉rho1基因条件性敲除株(rho1_teton)和rho1基因过表达株（rho1 OE）。在多西环素浓度较低时,rho1_teton中rho1基因表达明显降低(下文中如无特殊说明,rho1_teton均代表多西环素浓度较低时有少量rho1基因表达的菌株),当多西环素浓度为0时,rho1_teton无法生长;rho1 OE中的rho1基因表达则显著升高。rho1_teton孢子头缺损,顶囊瓶梗数目减少,产孢降低,烟曲霉生长速率减慢,在48℃时甚至停止生长,失去耐热性;rho1 OE的生长表型则与亲本基本无差别。进一步,我们发现rho1基因缺失引起的烟曲霉死亡可能是由于细胞质膜破裂、胞质泄露导致的细胞坏死现象,而不是凋亡、自噬等现象,提示rho1基因缺失导致烟曲霉细胞壁完整性受到严重损伤。接着,我们检测了Rho1在细胞壁应激中的可能作用。首先,发现rho1_teton对荧光白、刚果红这些细胞壁干扰剂的敏感性显著上升,rho1 OE敏感性无太大变化。进一步,我们利用免疫荧光技术检测了细胞壁表面多糖组成,发现与亲本菌株相比,rho1_teton表面β-1,3-葡聚糖和多糖共轭物表达显著减少,而rho1过表达株表面β-1,3-葡聚糖表达增多。同时,我们检测了rho1_teton和rho1 OE中细胞壁完整性（cell wall integrity,CWI）信号通路情况,发现当rho1低表达时,rho1_teton中CWI通路的MAPK三个激酶基因表达水平均下降,而且荧光白（Calcofluor white,CFW）诱导的MpkA磷酸化水平也受到明显抑制;这些结果为Rho1参与调控CWI通路提供了直接证据。紧接着,我们发现与亲本相比,rho1低表达的rho1_teton对H₂O₂和高pH的敏感性明显上升,而rho1过表达株的敏感性则基本无变化;进一步的研究发现是由于Rho1蛋白参与到高渗透压甘油（high osmolarity glycerol response,HOG）通路以及PacC通路中,通过激活SakA的磷酸化调节烟曲霉对H₂O₂和高pH的应激。Rho1表达改变对烟曲霉生长和应激能力的影响有可能会影响其致病性。首先,在免疫缺陷小鼠模型中,rho1 OE与亲本菌株的毒力无显著差异;但在大蜡螟模型中,rho1_teton的毒力与亲本菌株相比显著降低,但rho1 OE的致病性与亲本差别不大;据此,我们初步判断rho1基因的缺失可能导致烟曲霉致病性降低。进一步,我们用rho1_teton和rho1 OE孢子感染肺上皮细胞,发现当Rho1表达降低时,烟曲霉侵染率明显下降,但rho1 OE的侵染效率没有明显增加,表明烟曲霉内化侵入肺上皮细胞需要Rho1蛋白发挥作用。进一步研究发现,rho1_teton的培养上清或者孢子本身去刺激肺上皮细胞,都可以引起肺上皮细胞内炎性因子释放减少,提示rho1低表达可能会影响烟曲霉孢子表面成份改变以及烟曲霉外分泌成分改变,进而在与上皮细胞接触过程中诱发不同的炎症因子释放水平。我们还研究了Rho1表达改变对烟曲霉耐药性的影响,发现与亲本相比rho1_teton对唑类药物伊曲康唑敏感性上升,也不存在对棘白菌素类药物的矛盾效应;rho1OE对药物的敏感性与亲本相比无显著差异。最后,我们研究了Rho1与烟曲霉肌动蛋白解聚因子Cofilin的关系。在实验室前期构建的rho1_teton的基础上,导入能够过表达cofilin基因的质粒,构建了rho1_teton:cofilin OE菌株,也用同样的方法构建了cofilin _teton:rho1 OE菌株,发现rho1_teton中Cofilin蛋白表达受到抑制,当rho1基因表达升高时,Cofilin蛋白表达变化不大。在cofilin _teton:rho1 OE菌株中,Rho1表达的升高引起Cofilin表达水平的升高,同时重要转录因子PacC表达升高,在烟曲霉应对碱性应激中发挥作用。我们还进行了肌动蛋白骨架的免疫荧光染色分析,结果表明Cofilin的缺失可以引起肌动蛋白斑块（actin patch）的组装减少,影响肌动蛋白骨架的解聚和烟曲霉的极性生长。因此Rho1可能通过影响Cofilin的表达调控烟曲霉的生长过程。最后,我们挑选了cofilin和rho1转录组中共有的以及跟耐药和致病性相关的一些基因,对它们进行了敲除并进行了初步研究,发现SNARE蛋白Snc2的敲除株对于细胞壁干扰剂的敏感性上升。综上所述,本论文针对烟曲霉Rho1进行了系统而较为全面的研究,揭示了Rho1对烟曲霉生长、细胞壁完整性、胞外应激和耐药性的调控规律,以及在烟曲霉致病性中发挥的重要作用。鉴于烟曲霉Rho1与人同源蛋白RhoA的亲缘关系较远,本论文研究结果为寻找可能的新的抗曲霉感染药物靶点提供一定科学依据。