宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,其发病率在女性恶性肿瘤中居第二位。手术及放射治疗是宫颈癌的主要治疗手段,但宫颈癌常发生局部侵犯和淋巴转移,导致治疗失败。宫颈癌对一般的化疗药物又不敏感,所以,寻求新的治疗方法很有必要。　　 与许多实体肿瘤一样,宫颈癌组织内同样存在着血管、淋巴管的新生,血管、淋巴管密度与其恶性程度和生物学特性密切相关。因此,抑制宫颈癌血管和淋巴管生成可能会抑制肿瘤的进展。目前,抗血管形成治疗已有多种药物问世,但尚无特异的抗淋巴管形成制剂。内皮抑素是一种内源性血管生成抑制剂,亦是目前多种具有抑制肿瘤血管活性成分中最为理想的因子。但尚未见内皮抑素对宫颈癌的生长、转移有无影响的文献报导及与放化疗联合应用有无增效作用。本研究旨在通过体外及体内实验,阐明内皮抑素对宫颈癌进展的影响及其分子机制,为寻求宫颈癌新的治疗方法提供依据。研究分为三部分:　　 第一部分重组人内皮抑素对宫颈癌细胞HeLa生长侵袭的影响　　 目的:检测和观察内皮抑素对HeLa细胞的增殖、侵袭以及超微结构的影响　　 方法:体外培养宫颈癌HeLa细胞,加入重组人内皮抑素,采用MTT法测定细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期和凋亡;基底膜重建实验检测细胞移行;扫描及透射电镜观察细胞超微结构。　　 结果:　　 1内皮抑素对HeLa细胞增殖的影响　　 应用MTT法结果显示,加入重组人内皮抑素(20、10、5、1、0.5、0.1ug/mL)分别作用24h,48h,72h,与对照组比较,细胞增殖受到不同程度抑制,其抑制效果随作用浓度增加而加大且作用48h其抑制作用最显著。作用24h重组人内皮抑素浓度小于0.5ug/mL时,与对照组比较差异无显著性(P＞0.05)。作用48h各浓度均有抑制作用,与对照组比较差异有显著性(P＜0.05)。作用72h重组人内皮抑素浓度小于1ug/mL时,与对照组比较差异无显著性(P＞0.05)。　　 2内皮抑素对HeLa细胞的细胞周期和凋亡的影响　　 与对照组相比,在给药后24和48小时,内皮抑素组细胞G0/G1期比例增高,而S期细胞比例降低(p＜0.05)。72小时两组无差别。　　 在内皮抑素处理24小时即可出现凋亡细胞群。之后,凋亡率逐渐下降,24小时和48小时的凋亡率分别为1.45±0.149％和1.88+0.076％,均显著高于对照组(0.69+0.182％和1.37±0.142％,p＜0.05)。72小时两组之间无差别。　　 3内皮抑素对HeLa细胞移行的影响　　 内皮抑素组(0.1,0.5,1,5,10ug/mL)的移行抑制率分别为22.66％,33.59％,73.44％,80.86％,94.14％。实验组与对照组相比差异有显著性(P＜0.05),各内皮抑素组之间比较差异也有显著性(p＜0.05)。这一结果提示内皮抑素以浓度依赖方式抑制HeLa细胞的移行。　　 4内皮抑素对HeLa细胞超微结构的影响　　 扫描电子显微镜下:对照组可见粗壮的伪足,数目较多,有较明显的突起,分布密集。加入内皮抑素后,HeLa细胞伪足成细丝状,突起数量减少。　　 透射电子显微镜下:对照组细胞呈圆或椭圆形,胞质丰富,内有线粒体、粗面内质网、游离核糖体、溶酶体。细胞核不规则,偶有双核,在核旁的胞质里可见微丝、微管。内皮抑素组细胞则出现凋亡现象且核膜旁胞质内的微丝束消失。　　 结论:　　 1重组人内皮抑素在体外轻度抑制人宫颈癌细胞HeLa的增殖,对其侵袭的抑制作用则呈剂量依赖关系。　　 2重组人内皮抑素诱导HeLa细胞凋亡,增加G0/G1期细胞而减少S期细胞数量。　　 3重组人内皮抑素改变HeLa细胞的骨架结构。　　 第二部分重组人内皮抑素对裸鼠宫颈癌移植瘤血管、淋巴管形成的抑制作用及机制　　 目的:探讨重组人内皮抑素对其微血管密度、微淋巴管密度的影响,并进一步检测对肿瘤细胞内皮生长因子VEGF-A,VEGF-C,VEGF-D表达情况的影响　　 方法:　　 1以HeLa细胞建立裸鼠移植瘤模型,分为对照组和内皮抑素组,分别以CD31和LYVE-1标记血管和淋巴管,检测内皮抑素对血管、淋巴管形成的影响。　　 2采用免疫组织化学方法检测内皮抑素对宫颈癌裸鼠移植肿瘤VEGF-A,VEGF-C,VEGF-D表达的影响。　　 3采用Western blotting方法检测内皮抑素对HeLa细胞VEGF-A,VEGF-C,VEGF-D表达的影响。　　 结果:　　 1内皮抑素组、生理盐水组裸鼠肿瘤MVD平均值分别为10.83±2.29和22.08±1.93(P＜0.01)。内皮抑素组、生理盐水组裸鼠肿瘤MLD平均值为6.00±0.63和13.67±1.21(P＜0.05)。淋巴管主要分布在肿瘤间质中并呈扩张状态,在肿瘤实质内很少发现。在阳性淋巴管的管腔内发现有癌细胞存在。　　 2体内实验中,VEGF-A表达在肿瘤细胞和部分血管内皮细胞的细胞质中,显示为棕黄色的颗粒。内皮抑素组的VEGF-A阳性细胞的平均光密度值明显小于生理盐水组(P＜0.05)。VEGF-C,D都表达在肿瘤细胞的细胞质中。内皮抑素组VEGF-C,D的阳性细胞的平均光密度值均明显小于生理盐水组(P＜0.05)。　　 3体外实验中,对照组VEGF-A的表达水平比内皮抑素组高1.3倍;而对照组VEGF-C,D的表达水平分别比内皮抑素组高1.26倍和3.65倍。　　 结论:　　 1内皮抑素具有抑制HeLa裸鼠皮下移植瘤血管和淋巴管生成的双重作用。　　 2内皮抑素在体内及体外均抑制HeLa细胞VEGF-A,C,D的表达,可能由此而抑制血管和淋巴管生成,进而抑制肿瘤向淋巴结转移。　　 第三部分重组人内皮抑素联合同步放化疗对裸鼠宫颈癌移植瘤生长转移的抑制作用　　 目的:探讨重组人内皮抑素联合同步放化疗对宫颈癌移植瘤生长转移的影响　　 方法:建立动物模型,分为四组:对照组,同步放化疗组,内皮抑素组和内皮抑素联合放化疗组。采用精诺真体内成像系统、免疫组织化学、TUNEL、透射电子显微镜等技术检测各组肿瘤生长、转移情况,并检测乏氧诱导因子(HIF-1α)、增殖细胞核抗原(PCNA)等因子的表达水平以及肿瘤凋亡情况。　　 结果:　　 1从第3周开始,内皮抑素联合同步放化疗组与其他三组出现差异。实验结束时,第2、3、4组的光子数与对照组相比明显降低(P＜0.05)。而在第2、3、4组中,第4组(内皮抑素联合同步放化疗组)肿瘤的生长抑制最为显著(P＜0.05)。　　 2内皮抑素组和内皮抑素联合放化疗组的实验鼠淋巴结转移数各为25％(2/8),比同步放化疗组(42.8％,3/7)及对照组(66.7％,4/6)显著降低(p＜0.05)。　　 3 PCNA在内皮抑素联合放化疗组中的表达明显低于对照组(p＜0.01)、同步放化疗组(p＜0.05)及单纯使用内皮抑素组(p＜0.01)。第2组中PCNA的表达低于对照组和第3组(p＜0.05)。HIF-1α在第3组和第4组中的表达明显比1、2组(p＜0.05)降低。　　 4凋亡指数在第2、3、4组中分别是8.08±1.75％,10.99±2.86％和19.66±3.79％。这些指数均高于对照组的3.45±1.48％。第4组的凋亡指数明显高于第2、3组(P＜0.05)。　　 5透射电镜下:内皮抑素联合同步放化疗组的裸鼠肿瘤有较多凋亡细胞。低倍观察可见核染色质固缩,电子密度增高,细胞核碎裂,线粒体髓样化;高倍观察可见核碎裂块,粗面内质网轻度扩张,有脱颗粒现象,线粒体髓样化。　　 而在对照组内可见大量变性坏死的细胞,低倍观察细胞膜局部有缺损,胞质轻度水肿,局部区域变性坏死无结构。高倍观察可见线粒体大部分嵴消失,线粒体膜缺损,线粒体髓样化,胞质水肿有变性坏死,粗面内质网高度扩张,有脱颗粒现象。内皮抑素组和同步放化疗组介于两者之间。结论:　　 1内皮抑素联合同步放化疗治疗宫颈癌可能对肿瘤生长转移产生协同抑制作用。　　 2内皮抑素对放疗、化疗(顺铂)有增敏作用。