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猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）感染猪引起的急性、高度接触性肠道传染病,以呕吐、腹泻、脱水和仔猪高死亡率为主要特征,严重危害养猪业。不同日龄的猪对PEDV均易感,PEDV主要侵染小肠等消化道器官。PEDV与猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、猪轮状病毒A（Porcine rotavirus A,PRo VA）等感染导致的症状极其相似,临床上鉴别诊断比较困难,必须依靠实验室检测进行确诊。因此开展PED快速、精准诊断方法的相关研究,对于其综合防控意义重大。为了对近年来PEDV的流行病学进行系统调查,2015年～2017年我们分别从9个规模化猪场采集了腹泻猪只病料共计38份,使用商品化的TGEV/PEDV/PRo VA多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒对病料进行检测。结果显示,2015年采集的15份病料全部为PEDV阳性、TGEV和PRo VA阴性;2016年采集的12份病料中8份为PEDV阳性,4份为PEDV和PRo VA阳性;2017年采集的11份病料中7份为PEDV阳性,2份为PEDV、TGEV和PRo VA阳性。选取PEDV阳性的小肠组织在Vero-76细胞上进行病毒分离培养,通过连续传代,分离获得了1株PEDV,将毒株命名为PEDV2015-6株。为了实现对PEDV的快速、特异检测,我们建立了可用于PEDV、TGEV、PRo VA鉴别检测的多重实时荧光RT-PCR方法。特异性评价结果显示,该方法同时检测PEDV、TGEV和PRo VA三种病毒均为阳性,检测FMDV、CSFV、PRRSV、PCV2等均为阴性。敏感性评价结果显示,该方法对携带PEDV S基因、TGEV S基因和PRo VA NSP3基因的重组质粒的检测限分别为39 copies/μL、1.12 copies/μL和25copies/μL。重复性评价表明,该方法3次批间检测结果之间的CV值均小于5%。进一步利用该方法与商品化的TGEV/PEDV/PRo VA多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒同时对采集的38份病料进行检测,二者的符合率为100%。为了满足PEDV现场快速检测的需要,本研究研制了PEDV抗原量子点免疫层析检测试纸条。我们利用鼠抗PEDV的单克隆抗体10A8a株标记量子点探针,用鼠抗PEDV的单克隆抗体10F2a株包被硝酸纤维素膜制备检测试纸条。通过对50份空白对照样品进行检测,计算平均值以及标准偏差,将该试纸条的Cut-off荧光值定为102 A.U.。用该试纸条对已纯化的PEDV 2015-6株病毒稀释液进行检测,确定该试纸条的最佳反应时间为15 min。敏感性评价结果显示,该试纸条对已纯化的PEDV2015-6株病毒液(107.5 TCID50/ml)的最低检测稀释度为10-6(即101.5 TCID50)。特异性评价结果显示,该试纸条对所有PEDV阳性样本和疫苗的检测结果均为阳性,而对其它常见猪病原体的检测结果均为阴性。重复性评价结果表明,该试纸条对已纯化的PEDV 2015-6株病毒液每个稀释度20次检测的相对标准偏差RSD均小于10%。保存期评价结果显示,该试纸条37℃放置28 d,检测效果无明显变化。临床初步应用结果显示,该试纸条对38份临床病料检出34份PEDV阳性,而商品化的TGEV/PEDV/PRo VA多重实时荧光RT-PCR试剂盒检出36份PEDV阳性,二者的符合率为94.74%（36/38）。为了实现对乳汁中Ig A抗体的现场检测,我们建立了PEDV Ig A抗体的量子点免疫层析试纸条检测方法。首先,我们利用大肠杆菌表达了PEDV的重组蛋白S1。然后,用荧光量子点标记重组蛋白S1和兔Ig G,将硝酸纤维素膜T线包被灭活PEDV,将C线包被羊抗兔Ig G,组装成Ig A抗体量子点免疫层析试纸条。通过对50份空白对照样品进行检测,计算均值及标准偏差,确定该试纸条的Cut-off值为123 A.U.,并进一步确定该试纸条的最佳反应时间为10 min。敏感性评价结果显示,该试纸条对母猪初乳的最低检测稀释度为10-9,与商品化的PEDV抗体ELISA检测试剂盒敏感性一致。特异性评价结果显示,该试纸条对20份已免疫PEDV疫苗的母猪初乳的检测结果均为阳性,而对20份PEDV阴性猪场猪初乳的检测结果均为阴性。重复性评价结果显示,该试纸条对已免疫PEDV疫苗的母猪初乳10-5、10-6和10-7 3个稀释度样品的相对标准偏差分别为3.82%、7.61%和5.95%,均小于10%。保存期评价结果显示,该试纸条37℃放置28 d,检测荧光值变化很小。为了评价该试纸条的临床应用效果,我们从3个大型猪场采集母猪初乳样本共120份,利用该试纸条进行检测。结果显示,63份母乳中的PEDV Ig A抗体为阳性。随机抽取30份PEDV Ig A抗体阳性母乳和30份阴性母乳,分别送至上海出入境检验检疫局、湖南出入境检验检疫局、珠海出入境检验检疫局和重庆出入境检验检疫局利用该试纸条进行评价,并与商品化的PEDV抗体ELISA检测试剂盒进行比对。结果显示,两种检测方法的阳性符合率为93%。