木瓜凝乳蛋白酶基因克隆及其在毕赤酵母中表达研究

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该研究利用基因重组技术,将木瓜凝乳蛋白酶基因整合到毕赤酵母基因组中,构建了能够分泌表达木瓜凝乳蛋白酶的基因工程菌.首先从木瓜组织中分离总RNA,然后在反转录酶作用下以poly(dT)为引物将总RNA中mRNA反转录成cDNA.再根据已知木瓜凝乳蛋白酶基因序列以及毕赤酵母表达载体pPIC9K多克隆位点序列组成设计了一对特异性引物.最后以反转录产物为模板,通过优化PCR反应条件,克隆得到与目的基因大小一样的片段.为了表达与天然蛋白大小一致的木瓜凝乳蛋白酶,通过重组反应将木瓜凝乳蛋白酶基因直接插入到表达载体信号肽编码序列后面,构建了重组分泌表达载体pPIC9K-CP.重组表达载体经限制性核酸内切酶鉴定、PCR分析之后,对重组载体上的外源基因片段测序并进行序列分析,证明克隆到载体pPIC9K上的外源基因片段即为木瓜凝乳蛋白酶基因.
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