氧化葡萄糖酸杆菌(Cluconobacter oxydans)是革兰氏阴性、严格好氧的醋酸菌,因具有强大的不完全氧化能力,能够不完全氧化大量的碳水化合物、醇类及相关化合物而闻名,广泛应用于维生素C、食醋、葡萄糖酸、二羟基丙酮等大宗产品,以及D-塔格糖、米格列醇、手性醛和酸等新兴产品的生物技术生产过程。2005年葡糖杆菌属模式菌株G.oxydans 621H全基因组测序工作的完成,使该菌的代谢途径与分子水平研究,以及其所含酶类的生理生化性质成为了近几年的研究热点。G.oxydan 的天然生境中含有大量的有机化合物,如糖、醇、氨基酸和有机酸等,这些有机化合物的利用对G.oxydans的生存至关重要。G.oxydans 621H利用不同的糖和醇生长的能力已经被细致研究。本论文考察了G.xydans 621H在蛋白质氨基酸和大部分常见的有机酸上的生长能力,发现仅少数几种2-羟基竣酸(尤其是D-乳酸)能够支持G.oxydans 621H的生长,然而,有趣的是,丙酮酸作为D-乳酸的氧化产物却并不能支持该菌的生长,因此,G.oxydans 621H利用D-乳酸生长的驱动力似乎仅来源于D-乳酸的氧化过程,即D-乳酸仅作为能源支持G.oxydans621H的生长,这与其他已报道的乳酸利用菌株明显不同。本论文主要围绕G.oxydans621H这一独特的D-乳酸依赖性生长机制及所涉及的D-乳酸代谢酶的生理生化性质及应用展开深入研究。乳酸即2-羟基丙酸,是一种最常见的2-羟基羧酸,广泛存在于自然界中和生物体内。乳酸分子中包含一个不对称碳原子,因此按照旋光性可分为L-乳酸和D-乳酸。乳酸包含经基和羧基两种官能团,在微生物体内参与多种代谢反应,对微生物的生存、工业应用及部分致病菌的致病性等多个方面具有重要作用,因此微生物的乳酸代谢研究具有重要意义。微生物乳酸代谢的关键酶为NAD-依赖型乳酸脱氢酶(nLDH)和NAD-非依赖型乳酸脱氢酶(iLDH)。nLDH催化丙酮酸与乳酸相互转化的可逆反应,反应偏好向生成乳酸方向进行,主要在乳酸的合成代谢中发挥作用。iLDH催化乳酸转化为丙酮酸,没有测到逆反应活力,主要在乳酸的分解代谢中发挥作用,通常为支持微生物利用乳酸生长的关键酶。本论文通过对G.oxydans621H全基因组信息分析,鉴定出两个假定的D-iLDH(GOX1253和GOX2071)基因,进一步对这两个假定的D-iLDH展开性质鉴定和生理功能分析,以期阐明G.oxydans利用D-乳酸生长的机制。利用基因无痕敲除技术构建G.oxydans 621H的两个假定D-iLDH基因的单、双基因敲除菌株及基因回补菌株,证实GOX1253和GOX2071都能氧化D-乳酸,均为组成型表达,但亚细胞定位不同,GOX1253位于细胞膜上,GOX2071位于细胞质中。将GOX1253和GOX2071在Escherichia coli中外源表达,纯化蛋白的辅因子鉴定结果显示两者均以FAD为辅因子,GOX1253为同性四聚体,GOX2071为同型二聚体。对蛋白序列进行结构域分析及进化分析,显示GOX1253的N-末端为FAD-结合结构域,C-末端为膜结合的乳酸脱氢酶结构域,与来源于E.coli以醌为电子受体的D-iLDH具有较高同源性,这类蛋白目前只在细菌中发现;GOX2071的N-末端为FAD-结合结构域,但C-末端为FAD-氧化酶结构域,与已深入研究的D-iLDH同源性较低,这类蛋白广泛分布于生命体的三个域中。利用人工电子受体MTT测定两种蛋白的底物谱,结果显示GOX1253对D-乳酸的比酶活高达22.31 Umg-1,但底物谱较窄,且不具备严格的底物手性特异性,对L-乳酸也有一定酶活;GOX2071对D-乳酸的比酶活仅为0.35Umg-1,但底物谱相对较宽,立体选择性较高。考察了两者对不同人工电子受体的偏好性及直接利用分子氧作为电子受体的能力,结果显示GOX1253为典型的D-iLDH,而GOX2071为一种新类型的D-iLDH,即D-乳酸氧化酶。进一步对GOX2071的催化反应过程研究显示,GOX2071好氧催化D-乳酸氧化为丙酮酸和H2O2,生成的H202进一步在化学水平上将丙酮酸氧化为乙酸。考察了 G.oxydans 621H野生、基因敲除及回补菌株在D-乳酸催化过程及在D-乳酸上生长的差异,结果显示GOX1253是负责支持G.oxydans621HD-乳酸依赖性生长的关键酶。综合以上研究成果结合已报道的G.oxydas621HD代谢的相关特性,本论文提出了G.oxydans 621H的D-乳酸利用模型:D-乳酸通过乳酸透性酶(GOX2098)进入胞内,位于细胞膜内侧的GOX1253快速将其氧化,并将电子通过醌类传递给醌氧化酶,醌氧化酶在利用电子将O2还原为H20的同时向胞外泵出氢质子,形成的电化学质子梯度在FiFo ATP合酶作用下合成ATP,为菌体生长提供能量;由于该菌的TCA循环和EMP途径不完整,经GOX1253氧化D-乳酸生成的丙酮酸无法进入TCA循环进一步代谢,也无法通过糖异生生成六碳糖,而只能进入一个不产能的以乙酸为终产物的途径,即被丙酮酸脱羧酶(GOX1081)催化为乙醛,继而被乙醛脱氢酶(GOX2018)进一步氧化为乙酸积累;位于细胞质中的GOX2071也可能在D-乳酸氧化为乙酸的过程中发挥微量的作用。本论文不仅阐明了G.oxydan 利用D-乳酸生长的机制,也是通过实验鉴定出一种细菌中同时包含两种氧化D-乳酸的酶的首次报道。来源于G.oxydans621H中的GOX2071作为首个被鉴定出的D-乳酸氧化酶,很有必要对其酶学性质及催化机理进行深入研究。本论文首先利用人工电子受体MTT对GOX2071的基本酶学性质进行了初步研究,结果显示该酶的最适pH为8,最适温度为55℃,在温度低于50℃、pH为7-9的缓冲液中相对稳定,Cd2+,Zn2+,Co2+,Cu2+,Mn2+,Fe3+等金属离子对该酶表现出了明显的抑制作用,尤其是Cu2+和Fe3+,抑制了 90%以上的酶活。利用Clark型液相氧电极(Oxytherm)对GOX2071以分子氧为电子受体催化D-乳酸氧化的表观动力学常数进行了测定,确定GOX2071对D-乳酸的表观Km和Vmax分别为3.62±0.53 mM和0.52±0.04 U mg-1,对 02 的表观 Km 和Vmax 分别为 0.16±0.01 mM 和 0.97± 0.03 U mg-1。考查了 GOX2071厌氧条件下氧化D-乳酸的能力,发现厌氧条件下,与GOX2071共价结合的辅因子FAD(呈黄色)能够在该酶催化作用下被D-乳酸迅速地还原为无色的还原型FADH2,表明该酶促反应起点为酶与底物D-乳酸结合,迅速催化将D-乳酸的氧化,并将获得的电子转移至辅因子FAD上;动力学测定结果显示GOX2071的催化过程符合乒乓机制;进一步测定了两种催化反应产物(丙酮酸和H2O2)对催化反应的抑制作用,结果显示第一种产物丙酮酸对第二种底物O2表现出竞争性抑制,第二种产物H2O2对第一种底物D-乳酸表现出竞争性抑制,表明GOX2071催化D-乳酸氧化的反应机制符合单位点乒乓机制。光学纯的2-羟基羧酸是一类用于合成多种重要化合物的手性前体,广泛应用于医药、化工、生物合成等领域。外消旋2-羟基羧酸可以从生物资源中获得或者通过简单地化学方法大量合成,因此酶催化的动力学拆分法是生产光学纯2-羟基羧酸的常用方法。尽管早在上个世纪末氧化酶催化的动力学拆分法生产(R)-2-羟基竣酸已经实现,但由于缺乏相应的氧化酶,至今还未见氧化酶催化的动力学拆分法生产(S)-2-羟基羧酸的报道。针对这个问题,本论文通过分析大量假定D-乳酸氧化酶的序列特征及鉴定所需的相关特性等展开较为系统地筛选,发现来源于G.oxyans 621H的D-乳酸氧化酶,由于具备对该拆分过程诸多有利的特性,即溶解性好、底物谱广、立体选择性高等,被选为实现该过程最合适的催化剂。利用该D-乳酸氧化酶偶联过氧化氢酶,实现了一系列(S)-2-羟基羧酸的拆分法生产,产物产率高,光学纯度理想(>99%),同时该过程也获得了相应的2-酮基羧酸(另一种重要的有机合成和医药合成的中间体),所得产物浓度接近理论产物浓度。本论文开发的这一新的生产过程,是利用氧化酶动力学拆分法实现一系列光学纯(S)-2-羟基羧酸生产的首次报道,是光学纯(S)-2-羟基羧酸生产很有前景和希望的替代方法。(R)-2-羟基-4-苯基丁酸(R)-HPBA]作为一种重要的2-羟基羧酸,是生产血管紧张素转换酶抑制剂的重要前体,但目前已报道的(R)-HPBA的生产方法的生产产率和浓度仍然较低。本论文发现来自保加利亚乳杆菌ATCC 11842的NAD-依赖型D-乳酸脱氢酶(D-nLDH),其Y52L/F299Y双位点突变体(D-nLDHY52L/F299Y)对2-氧代-4-苯基丁酸(OPBA)具有较高的还原活力。随后,将该突变体D-nLDHY52L/F299Y与甲酸脱氢酶(FDH)在E.coli BL21(DE3)中共表达,构建了一种新型的生物催化剂五.coliDF,以甲酸作为辅助底物进行辅因子再生,利用OPBA生产(R)-HPBA。确定最适条件为:pH 6.5,底物浓度75mM,催化剂E.coliDF浓度6 gDCWL-1。在最适条件下,73.4 mMOPBA经过90min催化被还原为71.8mM(R)-HPBA,该过程的产物光学纯度(>99%)和生产效率(47.9 mMh-1)均到达目前报道的较高水平。