研究背景和目的：微小RNA（miRNA）是机体一类重要的基因表达调控分子，通过与靶mRNA的3’-UTR区域不完全配对结合，抑制其转录和翻译，与机体发育、细胞增殖和分化、DNA损伤修复、凋亡和肿瘤发生等众多生物学事件密切相关。miR-34a是p53诱导的miRNA，在DNA损伤应激中发挥重要作用。芥子气（sulfur mustard，SM）是皮肤损伤剂，引起皮肤炎症、红斑、水疱等病理改变，创面愈合缓慢。目前的研究结果认为芥子气对DNA的损伤作用是其引起病理变化的分子基础。我们推测，miR-34a的表达改变可能在SM对皮肤损伤过程中发挥作用，干预其表达可能会对皮肤的损伤及愈合有影响。因此，本研究中我们用miR-34a的抑制物Ago34a抑制角质形成细胞系HaCaT细胞中miR-34a的表达水平，观察芥子气模拟物CEES（2-chloroethyl ethyl sulfide，２－氯乙基乙硫醚）染毒后，角质形成细胞增殖、迁移、粘附、侵袭等指标的改变，以期明确miR-34a在硫芥损伤的保护作用，并对迁移，粘附，侵袭相关蛋白以及激动蛋白聚合状态（F-actin）等进行检测，以阐明其作用机制。研究结果可为后续在体研究，如使用miR-34a沉默药物治疗芥类毒物皮肤难愈损伤，提供实验资料。方法：第一部分CEES染毒HaCaT细胞miR-34a的变化1. CEES染毒HaCaT细胞模型建立及评价：采用不同CEES剂量（0.2,0.5,1.0，2.0mM）进行染毒，染毒后6h使用MTS法检测细胞活性，确定后续试验染毒的最佳剂量（该剂量对细胞活性有影响，但细胞可以耐受）。采用该剂量在染毒后24h光镜观察细胞形态变化。2.细胞分化标志物检测：根据上述的毒性实验结果，确定0.5mM CEES为最佳染毒剂量，使用该剂量染毒24h后，采用基底细胞未分化标志物角质蛋白5（K5）和分化标志物角质蛋白10(K10)对染毒后细胞的分化情况进行检测，以1.2mM Ca2+诱导分化处理作为阳性对照。3.用stem-loop Q-PCR法检测成熟miRNA：使用商品化的miRNA检测用引物，检测方法与试剂与Q-PCR检测mRNA类似。在正式的miRNA检测前，利用溶解曲线评价miRNA检测引物的质量，同时比较U6和5S作为内参在本染毒模型上的稳定性。第二部分miR-34a沉默对CEES染毒前/后细胞迁移，粘附的影响1.化学合成miRNA转染实验：通过转染效率实验对转染方法进行评价。用cy3荧光标记和未标记的miRNA抑制剂转染细胞，观察cy3阳性细胞率。miR-34a沉默采用的是商品化的miR-34a沉默（Ago34a）。2. Western blotting：实验设计为6组，分组如下， miR-34a沉默转染组（Ago34a）和对照抑制剂转染（Ago ctr）组，0.5mM CEES染毒miR-34a沉默转染组，0.5mM CEES染毒对照抑制剂转染组（Ago34a+0.5），p38抑制剂干预0.5mM CEES染毒miR-34a沉默转染组（Ago34a+0.5+P38inh），ERK1/2抑制剂干预0.5mM CEES染毒miR-34a沉默转染组（Ago34a+0.5+ERK1/2inh）,染毒后24h检测EGFR，ERK1/2总蛋白，以及p38和ERK1/2磷酸化水平。3.细胞划痕实验：实验分组同上。用于评价各种处理因素下细胞运动迁移的能力。4.细胞粘附实验：实验分组同上。用于评价各种处理因素下细胞粘附底物的能力。5.细胞侵袭实验：实验分组同上。用于评价各种处理因素下细胞穿透基质胶（Matrixgel）的能力。6.免疫荧光染色F-actin：实验分组同上。F-actin反映actin的聚合程度，与细胞骨架重塑、迁移、粘附等有关。本实验用于观察各种处理因素下细胞内F-actin的分布和荧光强弱。7.流式细胞术分析F-actin：实验分组同上。用于准确反映各种处理因素下细胞F-actin的平均荧光强度。8. Western Blotting：实验分组同上。主要检测各种处理因素下与迁移相关的蛋白（miR-34a的靶蛋白或非靶蛋白）的改变。9.生物信息学分析：与迁移相关的蛋白HDAC6，在miR-34a沉默后增加。使用TargetScan预测和Vector NTI手工比对，预测HDAC63’-UTR的可能miR-34a结合位点。第三部分miR-34a沉默促CEES染毒细胞迁移的其它因素1.流式细胞术检测胞膜蛋白Integrin β1：实验分组同前。检测了和细胞粘附，迁移相关Integrin β1可能和细胞黏附，迁移相关。2.流式细胞术检测细胞内Ca2+含量：实验分组同前。检测了和Integrin β1改变相关的Ca2+含量。3. HPLC能量代谢检测：实验分组同上。检测了可能和细胞迁移相关的能量代谢的变化。4. Western Blotting检测COX-10：实验分组同上。结果反映能量代谢中氧化磷酸化功能酶的含量变化。结果:1.在本实验室建立了CEES体外染毒模型，发现0.5mM CEES是最佳染毒剂量。该剂量下染毒HaCaT可以观察到细胞粘附、迁移和侵袭能力均降低。部分功能和结构蛋白如K5、iNOS、MMP-1、Fra-1降低显著，Integrin β1略有增加。2.0.5mM CEES染毒可以显著降低HaCaT细胞K5（基底细胞marker）。但形态学和K10的WB结果表明，并未有明显的细胞分化迹象。3.建立了稳定的stem-loop Q-PCR法检测成熟miRNANA，比较了U6和5S两个内参的稳定性（后者更佳），以此法检测了miR-34a在CEES染毒HaCaT细胞内随时间后剂量变化后的表达，发现miR-34a在0.2,0.5mM CEES染毒后12h-24h表达增加，至24h增加3倍左右，该调控是通过该细胞的突变p53来实现的。4.建立了高转染效率的miRNA转染方法。miR-34a沉默可以增加细胞迁移和粘附能力。同样，miR-34a沉默使0.5mM CEES染毒细胞迁移增加，该迁移能力的变化可以被p38和ERK1/2信号通路抑制剂所降低。miR-34a沉默并未使0.5mM CEES染毒细胞粘附增加。5. miR-34a沉默引起0.5mM CEES染毒后一些迁移相关靶蛋白及信号通路激酶磷酸化增加，如c-myc、c-Met、ARHGAP1、HDAC6，以及p38和ERK1/2的磷酸化。迁移相关的信号蛋白iNOS增加依赖于ERK1/2通路激活。Fra-1作为已报道的miR-34a靶蛋白未见增加。6. miR-34a沉默并未显著改变0.5mM CEES染毒细胞MMP-1, Integrin β1，Ca2+含量和能量代谢水平。7. miR-34a沉默显著增加染毒前/后迁miR-34a沉默引起0.5mM CEES染毒细胞的ERK1/2信号通路激活，经过ERK1/2抑制剂处理后，细胞出现明显的分化状态。伴随着胞内Ca2+浓度和Integrin β1的明显增加。结论及展望：miR-34a沉默可以显著增加迁移，并可以部分逆转CEES染毒引起的细胞迁移降低。miR-34a沉默后引起染毒细胞迁移增强的作用机制可能是：⑴p-p38和p-ERK1/2信号通路的激活；⑵c-Met蛋白表达增强，促使该通路的激活；⑶miR-34a靶蛋白ARHGAP1增加，可能引起下游迁移相关蛋白Rho GTPase增加；⑷HDAC6蛋白增加可能使骨架蛋白和组蛋白去乙酰化。本课题还有其它方面有待深入：⑴未在动物上开展在体验证实验；⑵使用的是p53突变型细胞株HaCaT，在研究毒性和DNA修复机制方面可能不够全面；⑶miR-34a靶蛋白改变后的功能没有进行干预研究，其作用是根据已有文献推测的。