论文部分内容阅读
目的:本研究旨在探讨细胞周期相关蛋白E2F1调控的自噬对高糖诱导的肾小管上皮细胞EMT的作用和机制,以及白藜芦醇(resveratrol,Res)是否可以通过下调E2F1促进自噬水平,进而抑制肾小管上皮细胞EMT的发生,为防治糖尿病肾病探寻新的有效靶点。方法:(1)通过尾静脉注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ),建立糖尿病大鼠模型并于12周处死大鼠;通过HE、Masson染色光镜下观察肾脏病理改变;免疫组织化学染色观察肾组织E2F1的表达情况;实时荧光定量(RT-qPCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)分别检测E2F1、自噬相关蛋白LC3、p62以及EMT指标E-cadherin、α-SMA和纤维化指标Collagen IV的表达。(2)正常糖(NG)和高糖(HG)培养NRK-52E细胞并于48h收集细胞蛋白及RNA样本,RT-qPCR和Western blot分别检测E2F1、LC3、p62以及E-cadherin、α-SMA和Collagen IV的表达。(3)在NRK-52E细胞中分别转染阴性对照质粒(Control,Con.)及E2F1敲低质粒(E2F1-shRNA)并于高糖环境下培养,分为HG+Con.组和HG+E2F1-shRNA组,于48h后收集细胞蛋白样本,Western blot检测E2F1、LC3、p62以及E-cadherin、α-SMA和Collagen IV蛋白的表达,RT-qPCR检测E2F1、α-SMA和Collagen IV mRNA的表达。(4)正常糖或高糖培养NRK-52E细胞并加入白藜芦醇(resveratrol,Res,浓度为25umol/L),48h后收集蛋白样本,Western blot检测E2F1、LC3、p62以及E-cadherin、α-SMA和Collagen IV的蛋白表达。(5)正常糖或高糖培养NRK-52E细胞并分别转染过表达E2F1空载质粒(Vector,Vec.)和过表达E2F1质粒(E2F1)并加入白藜芦醇,48h后收集蛋白样本,Western blot检测E2F1、LC3、p62以及E-cadherin、α-SMA和Collagen IV的蛋白表达。结果:(1)DN大鼠模型复制成功。HE和Masson染色结果显示:DN组大鼠肾组织发生纤维化病变。免疫组织化学结果表明:与正常对照组(NC)相比,DN组大鼠肾小管及间质中E2F1蛋白阳性棕黄色颗粒表达较多,并且DN组大鼠肾组织中E2F1、p62、α-SMA和Collagen IV蛋白和mRNA的表达均明显增多(P<0.05),LC3和E-cadherin蛋白和mRNA的表达均明显减少(P<0.05)。(2)(1)与正常糖组(NG)比较,高糖组(HG)E2F1、p62、α-SMA和Collagen IV蛋白和mRNA的表达均增加(P<0.05),LC3和E-cadherin蛋白和mRNA的表达均减少(P<0.05)。(2)与HG+Con.组相比,HG+E2F1-shRNA组E2F1、p62、α-SMA和Collagen IV蛋白和mRNA的表达均减少(P<0.05),LC3和E-cadherin蛋白表达显著增加(P<0.05)。(3)(1)HG+Res组E2F1、p62、α-SMA和Collagen IV的蛋白表达均减少(P<0.05),LC3和E-cadherin的蛋白表达均增加,自噬水平有所恢复(P<0.05)。(2)与HG+Res组比较,HG+Res+E2F1组E2F1、p62、α-SMA和Collagen IV的蛋白表达均增多(P<0.05),LC3和E-cadherin的蛋白表达均减少,自噬水平受到抑制;NG+Res+E2F1组的结果与HG+Res+E2F1组中相反。结论:(1)糖尿病肾病中E2F1的表达较多,E2F1可能是糖尿病肾病治疗的靶基因。(2)高糖培养的肾小管上皮细胞中,E2F1的表达增多,并且E2F1可能通过抑制自噬水平促进EMT的发生。(3)白藜芦醇可能通过下调E2F1的表达,减弱E2F1介导的自噬抑制,阻碍EMT的发生发展,减缓肾脏纤维化,保护肾脏。