随着新一代基因编辑技术 CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)系统的诞生,基因编辑进入了一个新时代。在CRISPR-Cas9系统中,Cas9在引导RNA的指导下在靶位点产生双链断裂(Double-stranded breaks,DSBs),激活DNA损伤修复实现基因编辑。而DNA的修复过程容易引发插入或缺失突变,甚至引起癌症等疾病。基因拷贝数变异(Copy　numbervariations,CNVs)形成的机制之一就是DSBs引发的染色体修复,而尚无研究表明CRISPR-Cas9系统的脱靶效应是否会引发基因组范围上的拷贝数变异。本研究旨在利用质粒介导的CRISPR-Cas9系统对细胞基因组进行编辑,并通过单细胞基因组测序检测全基因组范围上的拷贝数变异情况。主要研究成果如下:(1)选取适用于基因编辑的人类细胞系。利用磷酸钙转染法、脂质体转染法和电转法对三种人类细胞系MRC-5、NCI-N87、HCT-116进行瞬转测试,同时验证细胞两条同源染色体上待切割位点序列是否一致。结合以上两点因素,成功选定易转染且同源染色体上切割位点序列一致的HCT-116细胞作为实验细胞系。(2)PX459-CFTR质粒载体的构建。针对7号染色体上的囊性纤维化跨膜电导调节因子(Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator,CFTR)基因序列上选定的切割位点设计两条sgRNA,双链退火后连接PX459载体(该载体携带嘌呤霉素基因,可用于后续药物筛选),成功构建PX459-CFTR质粒载体。(3)细胞转染与阳性细胞的筛选。利用脂质体转染法将PX459-CFTR质粒载体转入HCT-116细胞,使用嘌呤霉素对转染后细胞进行三轮药物筛选,最终筛选获得成功转入质粒载体的阳性细胞。(4)阳性细胞的单细胞基因组扩增及高通量测序。挑取单个阳性细胞进行单细胞基因组扩增,并验证靶位点是否成功编辑。成功获取5个基因组成功编辑的单细胞,对其进行高通量测序及拷贝数变异分析,发现以MDA为原理扩增所得的细胞基因组并不适用于拷贝数变异的研究。本实验成功使用CRISPR-Cas9系统对哺乳动物细胞进行基因编辑,并采用MDA法对单细胞基因组进行扩增。高通量测序结果表明该方法扩增基因组覆盖率不均匀,导致测序结果产生偏差,无法精确定量基因组拷贝数。本实验结果表明MDA法不适用于拷贝数变异研究,后续应尝试使用其他扩增方式或结合其他检测方法如aCGH进行拷贝数分析。