[研究背景]脓毒症是指宿主对感染的反应失调,产生危及生命的器官功能障碍,是严重创伤、烧伤、休克后常见的并发症。近年来,尽管在严重脓毒症及脓毒性休克的抗感染、液体复苏、创面处理、器官支持治疗等方面已取得进展,但其病死率仍居高不下,是重症监护室(intensive care unit,ICU)病人的首要死亡原因。脓毒症患者免疫功能受到抑制,自身清除感染的能力降低,是患者感染难以控制的重要原因。抗生素的使用提高了脓毒症患者的救治成功率,但随着抗生素的长期应用,不敏感菌株大量繁殖,抗生素不能完全解决脓毒症时的感染问题。因此,如何改善脓毒症时患者自身的免疫功能从而有效地控制感染,是脓毒症防治的重要课题。脓毒症时,在多种细菌毒素及细胞因子的刺激下,中性粒细胞功能失调,趋化方向性受损,到达病原感染部位的中性粒细胞数量减少,不能有效抑制病原增殖,导致机体抵御感染的能力降低,影响重要脏器的功能,是脓毒症患者死亡的重要原因之一。进一步阐明脓毒症时中性粒细胞方向性受损的机制,寻找针对性的干预措施,使中性粒细胞向感染部位的趋化增强,可为脓毒症的抗感染治疗提供理论基础。内毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性细菌细胞壁表面的主要组成成分,过量的LPS可导致天然免疫细胞的过度活化,释放过多的炎症介质,通过自分泌、旁分泌和体循环作用于全身组织器官,是引起脓毒症时全身炎症反应综合征的重要原因。ATP是细胞内重要的能量分子,近年来,Junger等人发现中性粒细胞也可通过自分泌ATP途径对自身的趋化产生影响。中性粒细胞趋化时前端片足分泌的ATP通过自分泌途径激活自身局部的P2Y2受体,增强了细胞的运动功能,但当细胞整体都接受ATP的刺激时,中性粒细胞的趋化功能反而受到抑制,这提示胞外ATP亦可能是中性粒细胞趋化的抑制分子,但其具体分子机制目前并不明确。P2X1受体是ATP门控阳离子通道受体,与ATP结合后能迅速诱导细胞的Ca2+内流,是细胞重要的Ca2+内流通道。近年来的研究证实P2X1受体也表达于外周血中性粒细胞中,ATP可通过活化P2X1受体增强中性粒细胞的随机运动,但随机运动的中性粒细胞不具有方向性,损伤了其向趋化物的定向运动能力,减弱了中性粒细胞向感染部位的特异性趋化能力。Ca2+是细胞内重要的信号分子,参与调控了中性粒细胞的多种生物学功能,但过度的Ca2+内流对中性粒细胞的趋化则具有抑制作用,但其是否与P2X1受体的活化有关目前尚不明确。[研究方法]体内实验采用致死剂量和非致死剂量的大肠埃希菌腹腔注射,制作脓毒症感染小鼠模型和轻度局部感染小鼠模型,观察小鼠生存率,血细胞自动分析仪检测腹腔灌洗液、血液中性粒细胞数量,平板菌落计数法检测腹腔灌洗液、血液细菌含量。病理切片HE染色观察小鼠脓毒症后肝、肺损伤,ELISA试剂盒检测肝、肺IL-1β、IL-6细胞因子水平,MDA试剂盒检测肝、肺MDA含量,转录谱基因芯片检测中性粒细胞基因表达的差异。体外实验采用LPS刺激原代中性粒细胞模型,琼脂糖趋化实验检测中性粒细胞趋化距离,流式细胞仪检测中性粒细胞趋化分子受体表达及凋亡,高效液相色谱仪检测ATP释放,Western Blot检测Cx43蛋白磷酸化,激光共聚焦显微镜检测P2X1受体分布、Ca2+内流,原子力显微镜、场发射扫描电子显微镜检测中性粒细胞极性化,激光共聚焦显微镜检测骨架蛋白肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)磷酸化、极性化。采用CRISPR/Cas9慢病毒敲除HL-60早幼粒细胞株P2X1受体,1.3%二甲基亚砜处理HL-60细胞6d后分化成类中性粒细胞,原子力显微镜、场发射扫描电子显微镜检测中性粒细胞极性化,激光共聚焦显微镜检测骨架蛋白MLC磷酸化、极性化。[研究结果]体内研究发现脓毒症时中性粒细胞趋化功能受到抑制、清除感染能力受损,肝、肺组织病理损伤明显、炎症反应增强,进一步的基因芯片检测发现脓毒症时中性粒细胞TLR信号通路活化,LPS通过TLR4对中性粒细胞多种的趋化分子受体的表达产生调控作用。体外研究发现在脓毒症时重要的炎症刺激分子中LPS对中性粒细胞趋化的抑制作用最为明显,LPS通过促进Cx43通道开放分泌ATP, ATP作用于自身P2X1受体后引起过量的Ca2+内流,使中性粒细胞钙调蛋白MLCK活化,导致MLC异常磷酸化及极性化,抑制了中性粒细胞的趋化。P2X1受体敲除后,LPS对中性粒细胞的抑制作用被削弱,MLC磷酸化、极性化恢复正常。[研究结论]本研究通过体内、体外研究发现了 LPS刺激后自分泌ATP/P2Xl/Ca2+信号通路对中性粒细胞趋化的抑制作用,并揭示其对中性粒细胞骨架蛋白MLC异常极性化的作用及机制,这可能是脓毒症时中性粒细胞趋化受损的重要原因之一。