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黄花棘豆作为我国西部草原地区的主要毒害草之一,给畜牧业和生态环境造成巨大损失和破坏。黄花棘豆优势分布区多为干旱少雨且寒冷的地区,其迅速蔓延与自身极强的抗逆性密切相关。因此,对其抗逆机理研究成为解析黄花棘豆蔓延机制的重要突破点。但目前研究主要集中在分布情况的调查统计、化感作用和毒理研究等方面,尚未触及抗逆机理研究。研究表明逆境胁迫下转录因子参与的转录调控对植物生长至关重要,而NAC转录因子又是植物特有的广泛参与各种逆境胁迫的重要转录因子。因此,本研究以NAC转录因子为切入点,充分利用已经获得的黄花棘豆转录组差异基因的数据,筛选出响应逆境胁迫关键NAC转录因子,并对其进行生物信息学分析、生物学特征分析、表达谱分析和功能验证等方面的研究,以明确其调控方式与途径,进而从转录调控层面来探究黄花棘豆的分子抗逆机制,以期为解析其蔓延的内在机制提供新的依据。(1)根据黄花棘豆转录组测序数据分析及相关文献报道,确定注释为NAC转录因子的Unigene comp71824为研究目标。随后利用primer 5软件设计特异引物,从黄花棘豆幼苗中成功克隆到该基因,命名为OoNAC72。(OoNAC72基因序列全长1376 bp,ORF为996 bp,密码子起始位点在49 bp位置,密码子终止位点在1045 bp位置,编码331个氨基酸。利用NCBI的BlastX分析,结果显示黄花棘豆OoNAC72的N端含有一个长122(98～220)个氨基酸的NAM结构域,属于典型NAC转录因子。(2)对克隆得到的黄花棘豆OoNAC72基因序列进行生物信息学分析,发现黄花棘豆OoNAC72蛋白不具有跨膜结构域,不存在信号肽,强亲水性极强,推测其定位在细胞核内。OoNAC72蛋白含有7个糖基化位点和19个磷酸化位点。和已知NAC家族蛋白比对发现该蛋白在NAM结构域高度保守,而NAM结构域以外的部分具有较高多态性,同时NAM结构域可以被分为A～E五个亚区域,进化树显示该蛋白与蒺藜苜蓿、鹰嘴豆相似度最高,亲缘关系最近。(3)构建了pCAMBI1302-OoNAC72-eGFP植物融合表达载体,利用农杆菌介导烟草瞬时转化法进行对OoNAC72进行亚细胞定位分析,结果显示OoNAC72分布于烟草表皮细胞的细胞核中。同时,构建pGBKT7-OoNAC72酵母重组载体,通过酵母单杂交实验对OoNAC72转录因子进行转录激活活性分析,结果表明OoNAC72具有转录激活活性。整个生物学特征分析表明OoNAC72符合转录因子的基本特征。(4)运用qRT-PCR方法对黄花棘豆OoNAC72基因在干旱、高盐、低温胁迫处理与脱落酸、乙烯、赤霉素三种激素处理下的表达谱进行分析,结果显示:干旱、高盐、低温非生物胁迫均可显著诱导OoNAC72基因的表达;激素处理下受脱落酸高效诱导表达,而乙烯和赤霉素处理对OoNAC72基因的表达影响不显著。结果表明,OoNAC72基因可能通过依赖ABA的信号途径参与黄花棘豆对逆境胁迫的应答反应。(5)通过农杆菌介导的蘸花法遗传转化拟南芥(Col-0),T1代转基因植株经潮霉素培养基的筛选,DNA水平上的检测,确定OoNAC72基因已经整合到拟南芥基因组中。收获得到具有抗性的T1代阳性转基因拟南芥植株种子,播种,获得T2代植株幼苗,即将开展后续相关试验。