研究背景与目的：多发性骨髓瘤(multiple myeloma MM)是浆细胞的恶性增生性疾病,约占造血系统肿瘤的10%,为所有癌肿的1%左右。目前,临床上该病的治疗完全缓解率仍较低,中位生存期仅2-3年,即使获得完全缓解的患者经过一段时间后仍可能会复发,特别是那些具有细胞遗传学异常(约1/3)的患者。细胞遗传学在血液病的诊断、分型、指导治疗和预后判断中具有重要意义,然而多发性骨髓瘤的细胞遗传学研究进展相对缓慢,主要受限于两方面原因,一是由于骨髓瘤细胞增殖率低,细胞周期长,难于获得足够的分裂相进行分析；二是复杂核型多见且其带型不够清晰,难以识别所有的染色体改变,因此,需要改进骨髓瘤细胞的培养体系使骨髓瘤细胞更多的进入分裂期从而使骨髓瘤细胞分裂相增多,并提高异常核型检出率。骨髓瘤细胞在髓内除通过自分泌细胞因子促进自身恶性增殖外,也通过旁分泌作用影响骨髓基质细胞,骨髓瘤细胞和骨髓基质细胞相互作用,使骨髓微环境发生改变,对骨髓瘤细胞的生长起着重要的促进和支持作用。白介素-6(interleukin-6, IL-6)、粒-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)、血管内皮生长因子(vascular endothe-lial growth factor, VEGF)、胰岛素样生长因子-1 (Insulin-like growth factor-1, IGF-1)、脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)、肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor, HGF)等在骨髓瘤的发生中都发挥重要作用。IL-6可诱导免疫细胞增殖、分化,在活化、增殖的B细胞分化为浆细胞的过程中起关键作用,目前认为它是促进骨髓瘤细胞生长和生存的关键性细胞因子。当发生MM时,骨髓瘤细胞通过旁分泌细胞因子作用于作为靶细胞的T细胞,导致T细胞增殖的协同刺激因子GM-CSF活化,引起MM患者体内的骨髓瘤细胞的增殖,阻止细胞凋亡,维持骨髓瘤细胞的活力。在多发性骨髓瘤中,骨髓新生血管的发生与疾病进展和不良预后有关。VEGF、HGF、BDNF均可促进MM骨髓肿瘤血管新生,其中,VEGF作用最大,它除了可以促进骨髓肿瘤血管的新生,支持瘤细胞的浸润转移外,它还可以明显刺激骨髓基质细胞分泌IL-6,促进肿瘤生长。IGF-1与MM的发生密切相关,它可诱导膜脂筏上活化的胰岛素样生长因子1受体(Insulin-like growth factor 1 receptor, IGF-ⅠR)与β1整合素相关联,介导骨髓瘤细胞与纤维粘连蛋白(fibronectin, FN)的黏附及迁移。IL-6和VEGF可激活JAK2/STAT3促进骨髓瘤细胞生存,IL-6、VEGF和IGF-1可通过Ras/Raf/MEK/ERK通路促进骨髓瘤细胞增殖,IL-6. VEGF和IGF-1激活PI3-K/Akt通路介导抗凋亡及细胞耐药。IL-6、GM-CSF、VEGF和IGF-1可以促进骨髓瘤细胞的增殖,抑制其凋亡,因此可以在骨髓瘤细胞的培养体系中添加细胞因子以增加骨髓瘤细胞的比例,使骨髓瘤细胞的分裂相增多、异常核型的检出率提高并改善染色体制备不佳的状况。恶性细胞和正常细胞在体内外的细胞动力学不同,恶性细胞在体内的增殖率低于正常细胞,体外短期培养后恶性细胞增殖率增高,正常细胞的增殖率降低,故短期培养后恶性细胞比例增高。因此通过延长培养时间可以增加骨髓瘤细胞的比例,进而改善骨髓瘤的细胞遗传学问题。国内外对骨髓瘤细胞的培养体系进行研究,通过添加GM-CSF、IL-6+GM-CSF、IL-6+GM-CSF+IL-3等细胞因子及延长培养时间均使骨髓瘤细胞的分裂相增多并提高了异常核型的检出率。由于IL-6、VEGF和IGF-1通过相同的通路促进细胞增殖、抑制细胞凋亡,并且细胞因子之间具有协同促进的作用,故本实验在以往研究的基础上,除添加]IL-6+GM-CSF外还添加了新的细胞因子组合IL-6+VEGF+IGF-1建立新的培养体系并通过延长培养时间来增加骨髓瘤细胞的分裂相和提高异常核型的检出率。实验方法第一部分不同细胞因子组合对骨髓瘤细胞株RPMI8226和ARH-77的影响以多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226和ARH-77为研究对象,通过添加不同的细胞因子组合IL-6(10ng/ml)+GM-CSF(30ng/ml)和IL-6(10ng/ml)+VEGF(10ng/ml) +IGF-1(10ng/ml)建立新的培养体系培养骨髓瘤细胞,观察细胞因子组合对骨髓瘤细胞的数目、克隆形成、分裂指数和染色体核型的影响。实验分为3组,不添加细胞因子组(A组),添加IL-6(1 Ong/ml)+GM-CSF(30ng/ml)组(B组),添加IL-6(1 Ong/ml)+VEGF(1 Ong/ml)+IGF-1 (1 Ong/ml)组(C组)。分别计数第三天和第六天骨髓瘤细胞株RPMI8226和ARH-77在不添加细胞因子和添加B组C组细胞因子后的细胞数目。以甲基纤维素半固体培养法测定RPMI8226和ARH-77在不添加细胞因子和添加B组C组细胞因子组合后的体外克隆形成能力。不添加细胞因子和添加B、C组细胞因子培养RPMI8226和ARH-77六天后制备染色体,光学显微镜下观察并计数细胞分裂指数,用Leica CW4000 Karyo采图软件分析RPMI8226和ARH-77的核型,探讨细胞因子作用于骨髓瘤细胞是否会引起染色体的改变。第二部分不同培养体系和不同培养时间对正常人染色体核型分析的影响以正常人为研究对象,采用淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞,以常规1天培养法作为对照,以不添加细胞因子延长培养时间至6天法,添加B组细胞因子组合培养6天法,添加C组细胞因子组合培养6天法为MM的改良培养体系,在不同体系培养后制备染色体,用Leica CW4000 Karyo采图软件分析染色体核型,观察添加细胞因子和延长培养时间是否会引起染色体改变。第三部分不同培养体系和不同培养时间对多发性骨髓瘤病人染色体核型分析的影响以多发性骨髓瘤病人为研究对象,采用淋巴细胞分离液分离MM患者骨髓单个核细胞,以常规1天培养法作为对照,以不添加细胞因子延长培养时间至6天法,添加B组细胞因子组合培养6天法,添加C组细胞因子组合培养6天法为MM的改良培养体系,在不同体系培养后制备染色体,用Leica CW4000 Karyo采图软件分析染色体核型,观察添加细胞因子和延长培养时间是否会提高染色体核型检出率和异常核型检出率以及疾病分期和浆细胞比例对异常核型检出率的影响。统计学方法应用SPSS13.0软件进行数据处理,数据以均数±标准差表示(X±s),统计学方法包括单向方差分析(One-way ANOVA)和四格表资料的χ2检验和R×C表资料的χ2检验,方差齐时,组间多重比较采用bonferroni法,方差不齐时,组间多重比较采用Dunnett’s T3法,p<0.05提示差异具有统计学意义。实验结果第一部分不同细胞因子组合对骨髓瘤细胞株RPMI8226和ARH-77的影响1.1不同细胞因子组合对骨髓瘤细胞株RPMI8226和ARH-77增殖的影响细胞因子对ARH-77细胞有明显的促进增殖的作用。第3天添加细胞因子组与不添加细胞因子组的细胞计数差异具有统计学意义(F=57.488,P<0.001)；第6天添加细胞因子组与不添加细胞因子组的细胞计数差异具有统计学意义(F=151.817,P<0.001)。采用bonferroni法对第3天细胞计数进行组间比较,AB组间、AC组间存在显著差异(PAB=0.001, PAC<0.001), BC组间无显著性差异(PBC=0.334)。采用bonferroni法对第6天细胞计数进行组间比较,AB组间、AC组间存在显著差异(PAB<0.001,PAC<0.001),BC组间无显著性差异(PBC=0.539)。细胞因子对RPMI8226细胞没有明显的促进增殖的作用。第3天添加细胞因子组与不添加细胞因子组的细胞计数差异没有统计学意义,(F=2.616,P=0.152)；第6天添加细胞因子组与不添加细胞因子组的细胞计数差异没有统计学意义(F=4.659,P=0.060)。1.2不同细胞因子组合对RPMI8226、ARH-77克隆形成率的影响RPMI8226 A、B、C组在体外均有形成克隆的能力,且添加细胞因子组能够刺激RPMI8226细胞克隆的生长,以IL-6+GM-CSF组作用较强。RPMI8226在第10天时于倒置显微镜下观察,细胞已经形成克隆。A、B、C三组克隆形成数分别为91.00±4.58、205.67±6.03、175.67±6.03。A、B、C三组的克隆形成数目差异具有统计学意义(F=339.77,P<0.001)。三组之间两两比较均有显著性差异(PAB<0.001, PBC<0.001, PAC=0.002。由高倍镜下可以看出,添加细胞因子组与不加细胞因子组不仅体外克隆数有变化,而且克隆的大小也有很大差异。ARH-77在第21天时于倒置显微镜下观察,细胞已经形成克隆。ARH-77 A、B、C组在体外有形成克隆的能力,但其形成克隆的能力要明显弱于RPMI8226,添加细胞因子能够刺激ARH-77细胞克隆的生长,三组克隆形成数分别为9.67±1.53、18.33±1.53、21.67±2.52。三组的克隆形成数目差异具有统计学意义(F=31.394,P=0.001)。三组之间两两比较,AB组间、AC组间具有显著性差异(PAB=0.004, PAC=0.001), BC组间没有显著性差异(PBC=0.231)。高倍镜下可以看出,添加细胞因子组与不加细胞因子组不仅体外克隆数目有变化,而且克隆的大小也有很大差异。1.3不同细胞因子组合对RPMI8226、ARH-77细胞分裂指数的影响添加细胞因子组与不添加细胞因子组都可见分裂相。RPMI8226A、B、C三组的细胞分裂指数分别为1.96±0.40%、3.16±0.42%、2.84±0.37%。RPMI8226添加细胞因子组与不添加细胞因子组的细胞分裂指数的差异具有统计学意义(F=12.350,P=0.001)。三组之间两两比较,AB组间、AC组间有显著性差异(PAB=0.001, PAC=0.013), BC组间没有显著性差异(PBC=0.675)。细胞因子促进RPMI8226的分裂。ARH-77A、B、C三组的细胞分裂指数分别为1.70±0.31%、2.67±0.27%、2.40±0.31%。ARH-77不添加细胞因子组与添加细胞因子组细胞分裂指数的差异具有统计学意义(F=11.815,P=0.001)。三组之间两两比较,AB组间、AC组间具有显著性差异(PAB=0.002, PAC=0.015), BC组间没有显著性差异(PBC=0.682)。细胞因子促进ARH-77的分裂。1.4细胞因子组合对RPMI8226、ARH-77染色体核型的影响ARH-77、RPMI8226经细胞遗传学分析,RPMI8226为超二倍体,出现63-65条染色体,并出现lp-,6q-,15q-,+mar等结构改变,ARH-77为42-46条染色体,并出现-1,+2,-3,+4,6q-,-9,13q-,14q+,+mar等改变。添加细胞因子后,染色体核型分析与不加细胞因子组核型分析一致。添加细胞因子不引起染色体改变。第二部分不同培养体系不同培养时间对正常人染色体核型分析的影响对7名正常人进行染色体核型分析,其中男5例,添加细胞因子组、延长培养时间组和常规1d培养法制备染色体,分析20个分裂相,核型均为46,XY；女2例,在不同培养体系培养后制备染色体,分析20个分裂相,核型均为46,XX,添加细胞因子和延长培养时间后染色体核型并未发生改变,均为正常核型,添加细胞因子和延长培养时间并不引起染色体改变。第三部分不同培养体系不同培养时间对多发性骨髓瘤病人染色体核型分析的影响24例MM患者中有3例试验失败,不同处理组都不见细胞分裂相。另有2例1d培养法无分裂相,延长培养时间法和添加细胞因子法有分裂相,可以显带分析,其余19例顺利完成试验。1天培养法检出3例异常核型,6天培养法检出4例异常核型,添加IL-6(10ng/mL)+GM-CSF(30ng/mL)检出7例异常核型,添加IL-6(10ng/mL)+VEGF(10ng/mL)+IGF-1(10ng/mL)检出5例异常核型。病例1、病例4、病例5、病例9、病例12、病例14、病例15这7例经细胞因子作用6天后检出克隆性异常核型。Ⅲ期MM患者较Ⅰ、Ⅱ期患者异常核型检出率高(x2=5.250,P=0.022)。高浆细胞比例患者较低浆细胞比例患者异常核型检出率高(χ2=10.096,P=0.001)。结论1.IL-6+GM-CSF和IL-6+VEGF+IGF-1促进ARH-77的增殖,但对RPMI8226没有明显的增殖作用。2. IL-6+GM-CSF和IL-6+VEGF+IGF-1促进ARH-77、RPMI8226的克隆形成,并促进其分裂。3.添加IL-6+GM-CSF、IL-6+VEGF+IGF-1和延长培养时间并不引起染色体改变。4.添加细胞因子和延长培养时间都有提高染色体核型检出率和异常核型检出率的趋势,并且能提高染色体质量和分裂相数量。其中以添加IL-6(10ng/mL)+ GM-CSF(30ng/mL)作用最强,添IL-6(10ng/mL)+VEGF(10ng/mL)+IGF-1(10ng/mL)次之。本研究的创新点：既往的多发性骨髓瘤改良细胞遗传学研究主要是集中在添加IL-6和GM-CSF最新的研究表明,VEGF和IGF-1在MM的发病中具有重要作用,研究也越来越多,因此本研究添加新的一组细胞因子组合IL-6(10ng/mL)+VEGF(10ng/mL)+IGF-1 (10ng/mL)来探讨添加细胞因子对多发性骨髓瘤的染色体制备技术的改善问题。本研究的价值：本实验通过添加细胞因子和延长培养时间改进MM的染色体制备技术,提高了骨髓瘤细胞异常核型的检出率,对骨髓瘤的预后判断和治疗有一定的指导意义。