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非对称二甲基精氨酸（asymmetric dimethylarginine，ADMA）是一种内源性一氧化氮(nitric oxide，NO)合成酶(nitric oxide synthase，NOS)的抑制剂，在体内主要由二甲基精氨酸二甲胺水解酶(Dimethylargininedimethylaminohydrolases，DDAHs)来降解。大量流行病学调查显示，在心力衰竭、动脉粥样硬化、高血压、糖尿病、慢性肾病等患者的血浆中ADMA水平明显升高，但ADMA-DDAH通路在这些疾病的发生、发展中的作用及机制的研究还不充分。因此，本文通过基因敲除、过表达等研究手段，从细胞水平上探讨了DDAH1影响细胞氧化还原状态、凋亡和肾小管上皮-间质转化的分子机制。 一、DDAH1影响细胞氧化还原状态和凋亡的机制研究 大量实验数据表明，血浆中ADMA的积累、DDAH1活性/表达的降低以及miR-21水平的上调与多种疾病有相关性，但具体机制还不清楚。本论文中，我们以野生型和Ddah1基因敲除型小鼠成纤维细胞(MEF)为研究对象，研究了ADMA-DDAH1-miR-21信号通路在调节细胞氧化还原状态和细胞凋亡中的作用。研究结果表明，Ddah1缺失会显著提高ADMA的水平，引起细胞氧化应激，并且使MEF细胞对叔丁基过氧化氢及A23187诱导的细胞凋亡更敏感。然而，无论短时间（1-80μM，24小时）或长时间（10μM，10代）的ADMA处理均对MEF细胞的活性氧水平及凋亡敏感性没有显著影响。我们还发现，在Ddah1基因敲除的MEF细胞中，miR-21的水平升高了4倍。Ddah1基因敲除引起MEF细胞中miR-21表达的上调依赖于氧化应激和NF-κB的激活。另外，利用DDAH1的抑制剂PD404182处理MEF细胞也会引起miR-21表达上调。利用抑制miR-21水平的慢病毒感染Ddah1敲除的MEF细胞，能显著上调SOD2的表达水平、缓解叔丁基过氧化氢及A23187引起的细胞氧化应激和细胞凋亡。总而言之，DDAH1不仅是一种降解ADMA的酶，也可以通过miR-21依赖的途径调节细胞氧化应激和细胞凋亡。 二、DDAH1影响肾小管上皮-间质转化的机制研究 上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)在胚胎发育、创伤修复、纤维化和癌症进展过程中都发挥着重要作用。醛固酮(aldosterone，Aldo)是诱导EMT的重要因素，它可以通过引起线粒体功能紊乱、诱导氧化应激促进EMT的发生。Ddah1敲除能够引起细胞氧化应激和细胞凋亡，然而，DDAH1与EMT的关系还未见报道。本论文中，我们用醛固酮处理人肾小管上皮细胞系HK-2，结果发现DDAH1表达水平下降，ADMA水平升高，活性氧水平也随之升高。过表达DDAH1能够缓解醛固酮引起的EMT。在HK-2细胞中敲低DDAH1能够直接诱导EMT，Ddah1基因敲除的小鼠肾小管上皮细胞也发生了EMT。抗氧化剂NAC、tempol、MnTBAP和NO供体SNP均能缓解DDAH1缺乏引起的EMT。然而，ADMA处理对EMT过程没有显著影响。总而言之，DDAH1缺失通过诱导细胞氧化应激促进了EMT过程。